No abstract

A new method for obtaining transgenic sweet orange plants was developed in which positive selection (Positech) based on the Escherichia coli phosphomannose-isomerase (PMI) gene as the selectable marker gene and mannose as the selective agent was used. Epicotyl segments from in vitro-germinated plants of Valencia, Hamlin, Natal and Pera sweet oranges were inoculated with Agrobacterium tumefaciens EHA101-pNOV2116 and subsequently selected on medium supplemented with different concentrations of mannose or with a combination of mannose and sucrose as a carbon source. Genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot. The transgene expression was evaluated using a chlorophenol red assay and isoenzymes. The transformation efficiency rate ranged from 3% to 23.8%, depending on cultivar. This system provides an efficient manner for selecting transgenic sweet orange plants without using antibiotics or herbicides.

The development and optimization of efficient transformation protocols is essential in new citrus breeding programs, not only for rootstock, but also for scion improvement. Transgenic Hamlin sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck) plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of epicotyl segments collected from seedlings germinated in vitro. Factors influencing genetic transformation efficiency were evaluated including seedling incubation conditions, time of inoculation with Agrobacterium and co-culture conditions. Epicotyl segments were adequate explants for transformation, regenerating plants by direct organogenesis. Higher percentage of transformation was obtained with explants collected from seedlings germinated in darkness, transferred to 16 hours photoperiod for 2-3 weeks, and inoculated with Agrobacterium for 15-45 min. The best co-culture condition was the incubation of the explants in darkness, for three days in culture medium supplemented with 100 µM of acetosyringone. Genetic transformation was confirmed by performing ß-glucoronidase (GUS) assays and, subsequently, by PCR amplification for the nptII and GUS genes.Index terms: Citrus sinensis, epicotyls, seedlings, transgenics, breeding methods. Transformação genética de laranja Hamlin via AgrobacteriumResumo O desenvolvimento e otimização de protocolos eficientes de transformação genética é essencial nos programas atuais de melhoramento de citros, tanto para porta-enxertos, como para copas de valor comercial. Plantas transgênicas de laranja Hamlin (Citrus sinensis (L.) Osbeck) foram obtidas pela transformação genética de segmentos de epicótilo, coletados de plântulas germinadas in vitro, com Agrobacterium tumefaciens. Foram avaliados fatores que influenciam a eficiência da transformação genética, como: condições de incubação das plântulas utilizadas para coleta de explantes, tempo de inoculação com Agrobacterium e condições de co-cultivo. A regeneração de plantas a partir de segmentos de epicótilo ocorreu em alta freqüência, por organogênese direta. A maior porcentagem de plantas transgênicas foi obtida utilizando-se explantes coletados de plântulas germinadas no escuro e posteriormente transferidas, por 2-3 semanas, para condições de 16 horas de fotoperíodo, e infectados com Agrobacterium por um período de 15-45 minutos. As melhores condições de co-cultivo foram a incubação dos explantes no escuro, por três dias, em meio de cultura suplementado com 100 µM de acetoseringona. A transformação genética foi confirmada pelo teste histoquímico para ß-glucoronidase (GUS) e, posteriormente, pela amplificação de DNA, por PCR, para detecção dos genes nptII e GUS.Termos para indexação: Citrus sinensis, epicótilo, plântulas, transgênicos, métodos de melhoramento.

Exogenous genes can be introduced in plants by genetic transformation techniques. However, an efficient tissue culture system with high rates of plant recovery is necessary for gene introduction. This work aimed to define organogenesis and plant regeneration protocols for sweet orange varieties Natal, Valencia and Hamlin (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck) which can be used in plant transformation experiments. Seeds of which teguments were removed, were germinated in vitro and maintained in the dark for three weeks, followed by one week at 16-h photoperiod (40 µmol m -2 s -1 ) and 27 ± 2°C. Organogenesis induction was done by introducing epicotyl segments in MT medium with 25 g L -1 sucrose and different BAP concentrations. After adventitious bud growth, the shoots were transferred to MT medium with either NAA or IBA (1 mg L -1 ), or absence of auxin, for rooting. The best results were obtained with 1 mg L -1 BAP for bud induction and 1 mg L -1 IBA for rooting for all three sweet orange cultivars. The use of 0.5-2.5 mg L -1 BAP, followed by 1 mg L -1 IBA were the best growth regulator combinations for bud induction and rooting, respectively, for 'Rangpur' lime. The protocols presented in this work are suitable for associations with genetic transformation experiments for these cultivars.

Genetic transformation allows the release of improved cultivars with desirable characteristics in a shorter period of time and therefore may be useful in citrus breeding programs. The objective of this research was to establish a protocol for genetic transformation of Valencia and Natal sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck). Epicotyl segments of germinated in vitro plantlets (three weeks in darkness and two weeks in a 16-h photoperiod) were used as explants. These were cocultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA-105 and different experiments were done to evaluate the transformation efficiency: explants were co-cultivated with Agrobacterium for one, three or five days; explants were incubated with Agrobacterium suspension for 5, 10, 20 or 40 minutes; co-cultivation medium was supplemented with acetosyringone at 0, 100 or 200 µmol L -1; Explants ends had a longitudinal terminal incision (2-3 mm); co-cultivation temperatures of 19, 23 or 27°C were imposed. The experimental design was completely randomized in all experiments with five replications, each consisted of a Petri dish (100 x 15 mm) with 30 explants and resulted in a total of 150 explants per treatment. Longitudinal terminal incision in the explant ends did not improve shoot regeneration. However, transgenic plants of all three cultivars were confirmed from explants that had been subjected to inoculation time of 20 minutes, co-culture of three days at 23-27°C, in the absence of acetosyringone. Key words: genetic transformation, organogenesis, micrografting, improvement TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM Citrus sinensis E Citrus limonia MEDIADA POR Agrobacterium tumefaciens A PARTIR DE SEGMENTOS DE EPICÓTILORESUMO: A transformação genética permite produzir cultivares com características específicas e pode, dessa forma ser associada a programas de melhoramento de citros. O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética para as laranjas doce 'Valência' e 'Natal' (Citrus sinensis L. Osbeck), bem como para o limão 'Cravo'(Citrus limonia L. Osbeck). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro (três semanas no escuro e duas semanas sob fotoperíodo de 16h) foram utilizados como explantes. Estes foram co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105), realizando-se vários experimentos para avaliar a eficiência do processo de transformação genética: explantes co-cultivados por um, três e cinco dias; tempo de inoculação com a bactéria de 5, 10, 20 e 40 minutos; co-cultivo em meio de cultura contendo 0, 100 e 200 µmol L -1 de acetoseringona; Incisão longitudinal (2-3 mm) nas extremidades do explante; temperatura de co-cultivo 19, 23 e 27°C. Todos os experimentos consistiram de cinco repetições por tratamento, sendo cada repetição representada por uma placa de Petri contendo 30 explantes, perfazendo um total de 150 explantes por tratamento. Plântulas transgênicas dos três cultivares foram obtidas utilizando-se tempo de inoculação de 20 minutos, co-cultivo com Agrob...

O sucesso de técnicas biotecnológicas no melhoramento in vitro de Citrus depende diretamente do desenvolvimento de protocolos eficientes para regeneração de plantas. Objetivou-se avaliar o efeito de concentrações de 6-benzilaminopuria (BAP) na organogênese in vitro de limão-'Cravo' e laranja-'Pêra', bem como o efeito do seccionamento do explante em laranja-'Valência'. Para o limão-'Cravo', foram utilizados como explante, segmentos internodais de plântulas germinadas in vitro, cultivados em meio MT e variando-se as concentrações de BAP em 0; 2,5; 5; 7,5 e 10 mg.L-1. Nas laranjas-'Pêra' e 'Valência' os explantes foram segmentos do epicótilo de plântulas germinadas in vitro. Os explantes de laranja-'Pêra' foram cultivados em meio MT variando-se as concentrações de BAP em 0; 1; 2; 3 e 4 mg.L-1. Para a laranja-'Valência', metade dos explantes foram seccionados e cultivados em meio MT acrescido de 1,0 mg.L-1 de BAP. Todas as brotações obtidas foram alongadas no meio de cultura MT + 25 g.L-1 de sacarose + 1 mg.L-1 de ácido giberélico (GA3) e enraizadas no meio MT + 25 g.L-1 de sacarose + 0,5 g.L-1 de carvão ativado + 1 mg.L-1 de ácido naftaleno acético (ANA). O melhor resultado para o número de brotações adventícias foi obtido na concentração 2,5 mg.L-1 de BAP para limão-'Cravo', e nas concentrações 1,0 e 2,0 mg.L-1 de BAP para laranja-'Pêra'. O seccionamento dos explantes favoreceu a organogênese in vitro da laranja-'Valência', porém as brotações apresentaram menor índice de enraizamento.

-The present work aimed at maximizing the number of plantlets obtained by the micropropagation of pineapple (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. Pérola. Changes in benzylaminopurine (BAP) concentration, type of medium (liquid or solidified) and the type of explant in the proliferation phase were evaluated. Slips were used as the explant source, which consisted of axillary buds obtained after careful excision of the leaves. A Sterilization was done in the hood with ethanol (70%), for three minutes, followed by calcium hypochlorite (2%), for fifteen minutes, and three washes in sterile water. The explants were introduced in MS medium supplemented with 2mg L -1 BAP and maintained in a growth room at a 16h photoperiod (40 mmol.m -2 .s -1 ), 27 ± 2°C. After eight weeks, cultures were subcultured for multiplication in MS medium. The following treatments were tested: liquid x solidified medium with different BAP concentrations (0.0, 1.5 or 3.0 mg L -1 ), and the longitudinal cut, or not, of the shoot bud used as explant. The results showed that liquid medium supplemented with BAP at 1.5 mg L -1 , associated with the longitudinal sectioning of the shoot bud used as explant presented the best results, maximizing shoot proliferation. On average, the best treatment would allow for an estimated production of 161,080 plantlets by the micropropagation of the axillary buds of one plant with eight slips and ten buds/slips, within a period of eight months. Index terms:Ananas comosus, tissue culture, in vitro culture, in vitro clonal propagation. OTIMIZAÇÃO DO PROTOCOLO DE MICROPROPAGAÇÃO DO ABACAXIZEIRORESUMO -O objetivo do trabalho foi maximizar o número de brotações, buscando adequar o protocolo de micropropagação do abacaxizeiro-'Pérola', pela manipulação de concentrações de BAP, do estado físico do meio de cultura e do seccionamento das brotações na fase de proliferação. Mudas do tipo filhote foram utilizadas como fonte de explantes, que se constituíram de gemas axilares extraídas após a eliminação das folhas. A desinfestação procedeu-se com álcool 70% (três minutos) e, posteriormente, com hipoclorito de cálcio 2% (quinze minutos). Em seguida, os explantes foram estabelecidos em frascos contendo 15 mL do meio de cultura MS sólido, suplementado com 2,0 mg L -1 de BAP e permaneceram por 60 dias em câmara de crescimento. Na fase de proliferação, estudaram-se os meios de cultura MS sólido e líquido, as concentrações de BAP (0,0; 1,5 e 3,0 mg L -1 ) e o seccionamento longitudinal das brotações. Concluiu-se que o meio MS líquido favoreceu a indução de brotações. O seccionamento das brotações mostrou-se fundamental no aumento da taxa de multiplicação, e a concentração 1,5 mg L -1 de BAP promoveu a melhor resposta para o número de brotações. O trabalho demonstrou que se pode obter até 161.080 plântulas de abacaxi, no final de oito meses, partindo de uma única planta com oito filhotes e dez gemas axilares/filhote. Termos para indexação:Ananas comosus, cultura de tecidos, cultivo in vitro, propagação clonal in vitro.

RESUMO:A espécie medicinal Vernonia condensata, vulgarmente conhecida por alumã, pertencente à família Asteraceae, possui propriedades analgésicas e de proteção gástrica. A crescente utilização dessa planta no Nordeste, pelas propriedades terapêuticas, justifica a necessidade de medidas que minimizem o impacto de sua exploração nas reservas naturais. O objetivo desse trabalho foi multiplicar in vitro plantas de alumã sob diferentes concentrações de BAP e aclimatá-las. Gemas axilares foram desinfestadas em solução de álcool etílico 70%, durante 2 minutos e em solução de hipoclorito de sódio (2% de cloro ativo) na concentração de 3:1, durante 15 minutos, seguido de três lavagens em água destilada estéril. Os tratamentos para multiplicação consistiram em doses de BAP (0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 mg L -1 ) em meio MS semi-sólido. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com 5 repetições, contendo 10 gemas por repetição. Após 30 dias de cultivo observou-se maior taxa de explantes responsivos, 84% na concentração de 1,0 mg L -1 de BAP, com produção de 4,0 brotos/explante. Nos tratamentos 3,0; 4,0 e 5,0 mg L -1 ocorreu hiperhidricidade nas folhas. As microplantas de alumã provenientes da metodologia utilizada neste trabalho alcançaram 100% de sobrevivência na aclimatação. Palavras-chave: biotecnologia, plantas medicinais, cultura de tecidos ABSTRACT:In vitro multiplication and acclimation of Vernonia condensata Baker. The medicinal species Vernonia condensata, commonly known as "alumã", belongs to the family Asteraceae and has analgesic and gastric protective properties. The increasing use of this plant in the Northeast of Brazil due to its therapeutic properties justifies the need of measures to minimize the impact of its exploitation in natural reserves. The aim of this study was to multiply, in vitro, "alumã" plants under different BAP levels, acclimating them. Axillary buds were sterilized in 70% (v/v) alcohol solution for 2 minutes and in 75% sodium hypochlorite solution (2% active chlorine) at 3:1 concentration for 15 minutes, followed by three washings in sterile distilled water. Multiplication treatments consisted of different BAP levels (0.0; 1.0; 2.0; 3.0; 4.0 and 5.0 mg L -1 ) in semi-solid MS medium. The experimental design was completely randomized, with 5 replicates and 10 buds per replicate. After 30 days of cultivation, the highest rate of responsive explants was obtained: 84% at 1.0 mg L -1 BAP, producing 4.0 sprouts/explant. In the treatments 3.0, 4.0 and 5.0 mg L -1 , there were vitrified leaves. The "alumã" microplants used in this study had 100% survival in acclimation.