Agrobacterium-mediated transformation of Citrus sinensis and Citrus limonia epicotyl segments

Abstract

Genetic transformation allows the release of improved cultivars with desirable characteristics in a shorter period of time and therefore may be useful in citrus breeding programs. The objective of this research was to establish a protocol for genetic transformation of Valencia and Natal sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck). Epicotyl segments of germinated in vitro plantlets (three weeks in darkness and two weeks in a 16-h photoperiod) were used as explants. These were cocultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA-105 and different experiments were done to evaluate the transformation efficiency: explants were co-cultivated with Agrobacterium for one, three or five days; explants were incubated with Agrobacterium suspension for 5, 10, 20 or 40 minutes; co-cultivation medium was supplemented with acetosyringone at 0, 100 or 200 µmol L -1; Explants ends had a longitudinal terminal incision (2-3 mm); co-cultivation temperatures of 19, 23 or 27°C were imposed. The experimental design was completely randomized in all experiments with five replications, each consisted of a Petri dish (100 x 15 mm) with 30 explants and resulted in a total of 150 explants per treatment. Longitudinal terminal incision in the explant ends did not improve shoot regeneration. However, transgenic plants of all three cultivars were confirmed from explants that had been subjected to inoculation time of 20 minutes, co-culture of three days at 23-27°C, in the absence of acetosyringone. Key words: genetic transformation, organogenesis, micrografting, improvement TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM Citrus sinensis E Citrus limonia MEDIADA POR Agrobacterium tumefaciens A PARTIR DE SEGMENTOS DE EPICÓTILORESUMO: A transformação genética permite produzir cultivares com características específicas e pode, dessa forma ser associada a programas de melhoramento de citros. O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética para as laranjas doce 'Valência' e 'Natal' (Citrus sinensis L. Osbeck), bem como para o limão 'Cravo'(Citrus limonia L. Osbeck). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro (três semanas no escuro e duas semanas sob fotoperíodo de 16h) foram utilizados como explantes. Estes foram co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105), realizando-se vários experimentos para avaliar a eficiência do processo de transformação genética: explantes co-cultivados por um, três e cinco dias; tempo de inoculação com a bactéria de 5, 10, 20 e 40 minutos; co-cultivo em meio de cultura contendo 0, 100 e 200 µmol L -1 de acetoseringona; Incisão longitudinal (2-3 mm) nas extremidades do explante; temperatura de co-cultivo 19, 23 e 27°C. Todos os experimentos consistiram de cinco repetições por tratamento, sendo cada repetição representada por uma placa de Petri contendo 30 explantes, perfazendo um total de 150 explantes por tratamento. Plântulas transgênicas dos três cultivares foram obtidas utilizando-se tempo de inoculação de 20 minutos, co-cultivo com Agrob...

Transformação genética de laranja 'Valência' com o gene cecropin MB39

“…O parênquima do xilema mostra alta atividade da enzima fenilalanina-amônia-liase (PAL), a qual está envolvida na síntese de fenilpropanóides, precursores de lignina. O promotor do gene da PAL2, clonado de Citrus sinensis, variedade Madame Vinous, denominado CsPP, foi utilizado em plantas transgênicas de tabaco e citros, e demonstrou expressões do gene GUS no xilema e em células da epiderme de pecíolos (Azevedo et al, 2006 Almeida et al, 2003).…”

“…Além disso, a maioria das plantas cítricas transgênicas produzidas em outros trabalhos contém promotores constitutivos (Almeida et al, 2003). O uso de promotores que conferem expressão em tecidos ou células específicas evita uma expressão desnecessária do gene e reduz a possibilidade de interferência no desenvolvimento da planta.…”

Transformação genética de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 e avaliação de plantas transgênicas inoculadas com Xylella fastidiosa Wells et al.

“…A primeira laranja transgênica regenerada foi obtida a partir de células embriogênicas em suspensão da variedade 'Washington Navel' co-cultivadas com Agrobacterium tumefaciens (HIDAKA et al, 1990). Vários métodos de transformação genética já foram descritos para citros, como a introdução direta de DNA em protoplastos (KOBAYASHI; UCHIMIYA, 1989;VARDI;BLEICHMAN;AVIV, 1990;GUO et al, 2005), transformação via A. tumefaciens (MOORE et al, 1992;FLEMING et al, 2000;BOND;ROOSE, 1998;CERVERA et al, 1998;MOORE, 1999;MENDES et al, 2002;ALMEIDA et al, 2003), o bombardeamento de partículas em células vivas (KLEIN et al, 1987;YAO et al, 1996) e por eletroporação de protoplastos (HIDAKA; OMURA, 1993;NIEDZ et al, 2003).…”

“…Nos últimos anos, a maioria das plantas cítricas modificadas geneticamente apresentava, freqüentemente, algo em comum: o uso de um promotor constitutivo forte, como é o caso do promotor CaMV 35S (PEÑA et al, 1997;ALMEIDA et al, 2003;MOLINARI et al, 2004). Esse promotor confere uma alta expressão gênica por todos os tecidos da planta, não possuindo especificidade.…”

“…A perda de peso do fruto pode chegar a 75% (FUNDECITRUS, 2007 (MOORE et al, 1992;MENDES et al, 2002). Entretanto, a maioria das plantas transgênicas de citros produzidas atualmente, foram regeneradas utilizando-se promotores constitutivos fortes como o CaMV 35S (PEÑA et al, 1997;ALMEIDA et al, 2003;MOLINARI et al, 2004 Embora ocupe uma posição de destaque no mercado, nossa produtividade média, em torno de 2,0 caixas/planta/ano, ainda é baixa, quando comparada com outras regiões produtoras, como por exemplo, a Flórida, que alcança uma média de 6,0 caixas/planta/ano. Essa baixa produtividade está associada, ao fato de grande parte da citricultura não ser irrigada, mas principalmente, a problemas fitossanitários e a ausência de maior número de cultivares copa e porta-enxerto (MACHADO et al, 2005).…”