The comparison of temperature responses of two mytilids from the high (Brachidontes purpuratus) and low (Semimytilus algosus) intertidal zone of the Peruvian coast was carried out focusing on the production of micronucleus and nuclear abnormalities in gill tissue. Two temperatures (23 and 11°C) were evaluated, in presence of three mitomycin C concentrations as a stressor (0.02, 0.04 and 0.06 £ 10 ¡6 ), simulating hypothetical El Niño and La Niña conditions. Responses to extreme temperatures between both species were signiWcantly diVerent (P = 0.008). Frequency of micronuclei and nuclear abnormalities in S. algosus did not diVer statistically among the temperature treatments, whereas in B. purpuratus there was an observed signiWcant decrease in nuclear abnormalities (P = 0.012) and micronuclei frequencies (P = 0.002) between both temperature treatments. The low frequency of micronuclei observed at high temperature and mitomycin C suggests a better eYciency to stress resistance, as occurs during El Niño events, of the species from the higher intertidal zone of B. purpuratus compared to S. algosus from the lower intertidal zone.
ResumenEl presente trabajo describe la estandarización de las técnicas del Test de Micronúcleo (MN) y Ensayo Cometa para la evaluación del daño en el DNA de bivalvos marinos. La importancia de estas técnicas radica en que permiten evaluar la respuesta temprana al estrés ocasionado por agentes contaminantes y cambios ambientales. Tejidos branquiales de Semimytilus algosus y Aulacomya ater fueron utilizados para tratamientos in vivo e in vitro. Los tejidos fueron expuestos a los agentes mutagénicos Mitomicina C en concentraciones de 0,02; 0,04 y 0,06 x 10 -6 M y H 2 O 2 en una concentración de 100 μM con tiempos de evaluación de 1, 3, 6, 24 y 48 h. Diferentes soluciones para la colecta del tejido y aislamiento celular fueron evaluados obteniendo una mayor viabilidad celular en la solución salina CMFS, pH 7,3; en frío. El Test de Micronúcleo se modificó en la forma de obtener el disgregado celular, realizando la hipotonización en Citrato de sodio 0,9%, fijación en metanol por segundos posterior al frotis y la tinción con Giemsa 2%. La estandarización del Ensayo Cometa Alcalino, descrita por Wilson et al. (1998), se realizó modificando la suspensión celular en agarosa LMP (1% en solución Kenny, pH 7,5), la exposición a solución de lisis (pH 10 con DMSO y Tritón) con variaciones en el tiempo de 1 a 16 h, y la electroforesis en solución alcalina pH 13,7 y tinción con Bromuro de etidio y Nitrato de plata para geles de agarosa. Los cambios realizados en ambas técnicas permitieron obtener un alto número celular con morfología definida, observándose macrolesiones como la formación de MN y aberraciones nucleares, y la determinación cualitativa de microlesiones observadas por fragmentación y migración del DNA. Palabras claves: daño del DNA, micronúcleo, Ensayo Cometa alcalino, estrés, bivalvos AbstractThis work describes the standardization of Micronucleus Assay (MN) and Comet Assay techniques used for the evaluation of the DNA damage on marine bivalves. These techniques are important because they can evaluate the early stress response caused by pollutant agents and environmental changes. Branchial tissues of Semimytilus algosus and Aulacomya ater were used for in vivo and in vitro treatments. Tissues were exposed to the mutagenetic agents Mitomicine C in concentrations of 0,02; 0,04 and 0,06 x 10 -6 M and H 2 O 2 in concentration of 100 μM evaluated at 1, 3, 6, 24 and 48 h. Different solutions for the tissue collection and cell isolation were evaluated, obtaining more cell viability with cold CMFS pH 7,3 saline solution. Micronucleus Assay were modified in the obtaining of suspension cell, we used 0,9% Sodium citrate hipotonic solution, fixation in methanol for seconds after the spread and dyed with 2% Giemsa. The Alkaline Comet Assay protocol described by Wilson et al. (1998) was standardized modifying the single-cell suspension embedded in LMP Agarose (1% in Kenny solution, pH 7,5), the exposure at lysing solution (pH 10 with DMSO and Triton) with changes from 1 to 16 h, electrophoresis in alkaline solution pH 13,7 and d...
ResumenSe evaluó in vivo la capacidad citoprotectora del fruto de Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh Camu-camu frente al daño mutagénico producido por bromato de potasio (68,5 mg/k) sobre tres líneas celulares de ratón (hígado, riñón y células sanguíneas). Se utilizó ratones (n= 120) divididos en tres grupos los cuales bebieron ad libitum: TI= control negativo (solo agua) y el grupo TIII (control positivo); El grupo TII bebió el extracto acuoso (2% p/v) del fruto de camu-camu. A los diez días se inyectó una dosis única de KBr0 3 (68,5 mg/kg peso corporal) vía intraperitoneal, a los grupos TII y TIII. El tratamiento con camu-camu continuo 35 días más, luego los ratones fueron eutanizados para determinar la frecuencia del daño al DNA mediante el protocolo del ensayo cometa alcalino. El grupo TII mostró en todas las líneas celulares el efecto citoprotector del camu-camu (p< 0,05). El efecto dañino al DNA por la acción oxidativa del KBrO 3 es inhibido por el extracto acuoso del fruto de camu camu, probablemente por la presencia de los agentes antioxidantes como el Acido ascórbico y los flavonoides.Palabras clave: Camu-camu, Myrciaria dubia, Bromato de potasio, genotoxicidad, ensayo cometa. AbstractIt was evaluated in vivo the cytoprotective capacity of the fruit of Myrciaria dubia H.B.K. MC VAUGH "Camucamu (Myrtacea) against mutagenic damage caused by potassium bromate (68.5 mg/k) on three mouse cell lines (liver, kidney and blood cells). Mice (n = 120) were divided into three groups which drank ad libitum: distilled water; TI (negative control) and TIII (positive control), the TII group (positive control) drank the aqueous extract (2 %) of the fruit of Camu-camu. After ten days, only the TII and TIII groups were intraperitoneally injected with a single dose of KBr03(68.5 mg/k). The camu-camu treatment lasted 35 days more, where they were euthanized to determine the frequency of DNA damage by means of the alkaline comet assay protocol. It was observed in all cell lines a cytoprotective effect of camu-camu (p<0.05) with respect with the negative control. The DNA-damaging effects of oxidative KBrO 3 action is inhibited by the 2% aqueous extract of camucamu fruit, probably by the presence of antioxidants such as ascorbic acid and flavonoids.
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