Aplicación de dos biomarcadores para el análisis de lesiones en el DNA de bivalvos marinos

Abstract

ResumenEl presente trabajo describe la estandarización de las técnicas del Test de Micronúcleo (MN) y Ensayo Cometa para la evaluación del daño en el DNA de bivalvos marinos. La importancia de estas técnicas radica en que permiten evaluar la respuesta temprana al estrés ocasionado por agentes contaminantes y cambios ambientales. Tejidos branquiales de Semimytilus algosus y Aulacomya ater fueron utilizados para tratamientos in vivo e in vitro. Los tejidos fueron expuestos a los agentes mutagénicos Mitomicina C en concentraciones de 0,02; 0,04 y 0,06 x 10 -6 M y H 2 O 2 en una concentración de 100 μM con tiempos de evaluación de 1, 3, 6, 24 y 48 h. Diferentes soluciones para la colecta del tejido y aislamiento celular fueron evaluados obteniendo una mayor viabilidad celular en la solución salina CMFS, pH 7,3; en frío. El Test de Micronúcleo se modificó en la forma de obtener el disgregado celular, realizando la hipotonización en Citrato de sodio 0,9%, fijación en metanol por segundos posterior al frotis y la tinción con Giemsa 2%. La estandarización del Ensayo Cometa Alcalino, descrita por Wilson et al. (1998), se realizó modificando la suspensión celular en agarosa LMP (1% en solución Kenny, pH 7,5), la exposición a solución de lisis (pH 10 con DMSO y Tritón) con variaciones en el tiempo de 1 a 16 h, y la electroforesis en solución alcalina pH 13,7 y tinción con Bromuro de etidio y Nitrato de plata para geles de agarosa. Los cambios realizados en ambas técnicas permitieron obtener un alto número celular con morfología definida, observándose macrolesiones como la formación de MN y aberraciones nucleares, y la determinación cualitativa de microlesiones observadas por fragmentación y migración del DNA. Palabras claves: daño del DNA, micronúcleo, Ensayo Cometa alcalino, estrés, bivalvos AbstractThis work describes the standardization of Micronucleus Assay (MN) and Comet Assay techniques used for the evaluation of the DNA damage on marine bivalves. These techniques are important because they can evaluate the early stress response caused by pollutant agents and environmental changes. Branchial tissues of Semimytilus algosus and Aulacomya ater were used for in vivo and in vitro treatments. Tissues were exposed to the mutagenetic agents Mitomicine C in concentrations of 0,02; 0,04 and 0,06 x 10 -6 M and H 2 O 2 in concentration of 100 μM evaluated at 1, 3, 6, 24 and 48 h. Different solutions for the tissue collection and cell isolation were evaluated, obtaining more cell viability with cold CMFS pH 7,3 saline solution. Micronucleus Assay were modified in the obtaining of suspension cell, we used 0,9% Sodium citrate hipotonic solution, fixation in methanol for seconds after the spread and dyed with 2% Giemsa. The Alkaline Comet Assay protocol described by Wilson et al. (1998) was standardized modifying the single-cell suspension embedded in LMP Agarose (1% in Kenny solution, pH 7,5), the exposure at lysing solution (pH 10 with DMSO and Triton) with changes from 1 to 16 h, electrophoresis in alkaline solution pH 13,7 and d...

Efecto citoprotector del camu-camu Myrciaria dubia en tres líneas celulares de ratón expuestos in vivo a bromato de potasio

“…El grado de daño al DNA siguió el patrón de clasificación descrito por Sotil et al (2007), el cual compara la cantidad observada en el núcleo denominado "cabeza" con la extensión de DNA llamado "cola"; se pueden considerar 5 niveles: Grado 0 o células no dañadas, sin cola; grado 1 o células ligeramente dañadas, con cola menor al tamaño de la cabeza, grado 2 o células dañadas, con cola igual al tamaño de la cabeza, grado 3 o células fuertemente dañadas, con cola mayor al tamaño de la cabeza, y grado 4 o células en apoptosis.…”

Determinación del estado de salud de dos poblaciones de Pteria sterna presentes en sitios con diferente grado de contaminación mediante la evaluación de biomarcadores bioquímicos y genéticos

“…La frecuencia de micronúcleos se estimó de acuerdo a la técnica modificada de Márquez (1993) (56) . De las muestras de branquia fijadas con etanol absoluto y ácido (57,59,60) donde se considera que un MN debe mostrar un tamaño igual o menor a un tercio del núcleo principal (Tabla 2).…”