No abstract

Recent years have brought great focus on the development of drug delivery systems based on extracellular vesicles (EVs). Considering the possible applications of EVs as drug carriers, the isolation process is a crucial step. To solve the problems involved in EV isolation, we developed and validated a new EV isolation method—low-vacuum filtration (LVF)—and compared it with two commonly applied procedures—differential centrifugation (DC) and ultracentrifugation (UC). EVs isolated from endothelial cell culture media were characterized by (a) Transmission Electron Microscopy (TEM), (b) Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), (c) Western blot and (d) Attenuated Total Reflection Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR). Additionally, the membrane surface was imaged with Environmental Scanning Electron Microscopy (ESEM). We found that LVF was a reproducible and efficient method for EV isolation from conditioned media. Additionally, we observed a correlation between ATR-FTIR spectra quality and EV and protein concentration. ESEM imaging confirmed that the actual pore diameter was close to the values calculated theoretically. LVF is an easy, fast and inexpensive EV isolation method that allows for the isolation of both ectosomes and exosomes from high-volume sources with good repeatability. We believe that it could be an efficient alternative to commonly applied methods.

No abstract

No abstract

Cholesterol jest prekursorem w syntezie witaminy D, kwasów żółciowych i hormonów sterydowych. Jego utlenione formy zwane oksysterolami są produktem pośrednim w syntezach, ale także regulują metabolizmem cholesterolu poprzez oddziaływanie na receptory komórkowe. Cholesterol jest ważnym składnikiem błon komórkowych. Oksysterole wykazują większą aktywność biologiczną niż sam cholesterol, mając działanie plejotropowe na różne typy komórek organizmu wywołują często przeciwstawne efekty. Oksysterole w przeciwieństwie do cholesterolu mogą przenikać barierę krew-mózg i wpływać na działanie układu nerwowego. Utlenione formy cholesterolu mogą oddziaływać na etiopatogenezę chorób nowotworowych. Podwyższony poziom oksysteroli w tkankach często towarzyszy wielu stanom patologicznym: jak cukrzyca, miażdżyca, demencja lub endometrioza. Utlenione formy cholesterolu mogą hamować lub aktywować różne komórki układu odpornościowego regulując procesami odpowiedzi immunologicznej w przebiegu chorób wirusowych i zapalnych.

Niepożądane działania leków stanowią istotny problem w farmakoterapii. Zaobserwowane działania uboczne mogą mieć wiele przyczyn. Mogą one zależeć od dawki i rodzaju zastosowanego leku. Mogą wystąpić w trakcie terapii lub pojawić się z opóźnieniem, po jej zakończeniu. Mogą zniknąć po przerwaniu leczenia lub utrzymywać się. W tym przeglądzie podsumowujemy obszerną literaturę dotyczącą fosfolipidozy, która jest główną konsekwencją stosowania kationowych leków amfifilowych (CAD). Ich specyficzna budowa chemiczna powoduje gromadzenie się fosfolipidów wewnątrz lizosomów, co wpływa na ich prawidłową funkcję, jednak mechanizm powstawania fosfolipidozy na poziomie molekularnym nie jest do końca poznany. Istnieje kilka hipotez mechanizmu powstawania fosfolipidozy - dotyczą one głównie: tworzenia kompleksów pomiędzy fosfolipidami a lekami CAD, kompetycyjnej inhibicji lizosomalnych fosfolipaz przez leki CAD oraz zwiększonej biosyntezy fosfolipidów i cholesterolu pod wpływem działania leku. W wyniku kumulacji fosfolipidów w lizosomach w obrazie mikroskopowym widoczne są tzw. ciałka blaszkowate, które mogą pojawić się w tkankach w kilka dni lub tygodni po podaniu CAD in vivo i jest to proces dawko-zależny. Uważa się, że fosfolipidoza jest procesem odwracalnym i przyjmuje się, że stanowi adaptacyjną - a nie toksyczną - reakcję na leki. Jeśli stężenie CAD lub toksycznej substancji skumulowanej w lizosomach przekroczy wartość krytyczną, może dojść do aktywacji procesu apoptozy i autofagii. Fosfolipidozę mogą wywołać także inne leki niż CAD, oksysterole oraz niektóre nanocząstki. Fosfolipidoza stanowi jeden z najsłabiej dotychczas poznanych powikłań farmakoterapii - nadal poszukiwane są zarówno sposoby jej wykrywania na początkowym etapie, jak również pełne spektrum zaburzeń czynnościowych organizmu. Identyfikacja procesu fosfolipidozy w komórkach jest możliwa poprzez badania w mikroskopii elektronowej stwierdzającej obecność ciałek blaszkowatych w tkankach pochodzących z biopsji lub za pomocą technik real-time PCR badającej ekspresję genów skorelowanych z występowaniem fosfolipidozy. Potencjalnym biomarkerem wykrywającym ten proces w krwi i moczu pacjentów jest bis(monoacyloglicero)fosforan (BMP). Fosfolipidoza wywołana działaniem substancji leczniczej może zostać wykryta na etapie badań przedklinicznych. Jednak akumulacja fosfolipidów i powstanie ciałek blaszkowatych stwierdzone w badaniach in vitro, czy w badaniach na zwierzętach, nie musi oznaczać uszkodzenia narządów w organizmie człowieka. W ostatnich latach obserwuje się wzrost zainteresowania mechanizmem procesu fosfolipidozy oraz badaniem nowych substancji leczniczych pod kątem wywoływania tego niepożądanego działania. Niniejsza praca przeglądowa przedstawia omówienie najistotniejszych dotychczasowych badań związanych z mechanizmem powstawania fosfolipidozy, metodami jej identyfikacji oraz skutkami na poziomie komórkowym, a także całego organizmu.

Recent years brought great focus in the field of development of extracellular vesicles (EVs) based drug-delivery systems. Considering possible applications of EVs as a drug carriers the isolation process is a crucial step. To solve problems related with EV isolation, we created and validated a new EVs isolation method – Low Vacuum Filtration (LVF) and compared it with two commonly applied procedures - differential centrifugation (DC) and ultracentrifugation (UC). EVs isolated from endothelial cells culture media have been characterized by a) transmission electron microscopy (TEM) b) nanoparticle tracking analysis (NTA), c) western blot and d) Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). Additionally, the membrane surface have been imaged with Environmental Scanning Electron Microscopy (ESEM). We showed that LVF is reproducible and efficient method for EVs isolation form conditioned media. Additionally, we observed correlation between ATR-FTIR spectra quality and the EVs and proteins concentration. ESEM imaging confirmed that actual pore diameter are close to the values calculated theoretically. LVF method is an easy, fast and inexpensive EVs isolation method which allows for isolation of both ectosomes and exosomes from high volume sources with good repeatability. We think that it could be an efficient alternative for commonly applied methods.