Uji fitokimia kualitatif menunjukkan biji kelengkeng mengandung senyawa bioaktif flavonoid, glikosida, saponin dan tanin, sehingga berpotensi sebagai antibakteri. Sedangkan nanokitosan, selain memiliki aktivitas antibakteri, dapat juga dijadikan penghantar obat-obatan dan ekstrak tanaman. Penelitian ini bertujuan membandingkan perbedaan efektivitas campuran nanokitosan 1% dengan ekstrak biji kelengkeng konsentrasi 80%, 60%, 40% dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Pembuatan ekstrak biji kelengkeng dilakukan dengan metode maserasi dan dibuat dalam konsentrasi 80%, 60%, 40%. Adapun nanokitosan 1% dibuat dengan metode gelasi ionik. Kedua bahan tersebut dicampurkan dengan perbandingan 1:1. Uji antibakteri terhadap campuran ekstrak dan nanokitosan tersebut menggunakan metode difusi cakram. Hasil penelitian menunjukkan mean daya hambat dari campuran konsentrasi 80% adalah 9.38 mm; konsentrasi 60% (8,47 mm) dan konsentrasi 40% (7,10 mm). Uji statistik one way ANOVA menunjukkan bahwa campuran yang paling efektif dalam menghambat Staphylococcus aureus terlihat pada konsentrasi 80% dibandingkan konsentrasi 60% maupun 40%, dimana p=0.000 (p<0.05). Hasil penelitian ini menunjukkan pertambahan konsentrasi ekstrak biji kelengkeng meningkatkan daya hambat terhadap Staphylococcus aureus. Hal ini disebabkan oleh adanya peningkatan jumlah kandungan senyawa aktif dari ekstrak biji kelengkeng seiring dengan pertambahan konsentrasi sehingga meningkatkan efektivitasnya dalam merusak sel Staphylococcus aureus.