Steroidumwandelnde enzyme aus mikroorganismen VI.—Reinigung einer 4-En-3-oxosteroid: (Akzeptor)-1-En-oxidoreduktase aus Nocardia opaca durch affinitätschromatographie

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Steroidumwandelnde Enzyme aus Mikroorganismen V. Reinigung einer 4-En-3-oxosteroid : (Akzeptor)-I -en-oxidoreductase aus Nocardia opaca und Charakterisierung der prosthetischen Gruppe N. N. LESTROVAJA, S. DANHARDT und C. HORHOLD (Eingegangen am 24.12.1976) Fur die Reinigung der 4-En-3-oxosteroid :(Akzeptor)-1-en-oxidoreductase aus Nocardia opaca wurden folgende Methoden angewandt : Abtrennung der Nucleinsiiuren rnit Streptomycinsulfat, fraktionierte Proteinfiillung mit Ammoniumsulfat, Gelfiltration an Sephadex G-100, Chromatographic und Rechromatographie an DEAE-Cellulose. Dabei konnte das Enzym 16Ofach mit einer Ausbeute von 40% angereichert werden. Die Steroid-1-Dehydrogenasekativitat wurde durch NAD, NADP und FMN nicht beeinflu&, FAD zeigte dagegen einen positivcn Effekt.Bei Behandlung mit Ammoniumsulfat unter muren Bedingungen zur Dissoziation in Proteinanteil und prosthetische Gruppe konnte eine Apoenzympraparation hergestellt werden, die nur noch geringe Aktivitat aufwies. Durch Zugabe von FAD in niedriger Konzentration erfolgte eine

Section: E a E -C E L L U L O S E -C H R O M A T O G R A P H I Eunclassified

Steroidumwandelnde Enzyme aus Mikroorganismen. V. Reinigung einer 4‐En‐3‐oxosteroid: (Akzeptor)‐1‐en‐oxidoreductase aus Nocardia opaca und Charakterisierung der prosthetischen Gruppe

Lestrovaja¹,

Dänhardt²,

Hörhold³

1978

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Steroidumwandelnde Enzyme aus Mikroorganismen IX. Affinitätschromatographische Präparation und Untersuchung des Apoenzyms einer 4‐En‐3‐oxosteroid: (Akzeptor)‐1‐en‐oxidoreduktase aus Nocardia opaca

Atrat

Deppmeyer

Hörhold

et al. 1979

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prosthetic group and apoenzyme were separated quantitatively by means of affinity chromatography in the presence of 2 M (NH,),SO, at p H 3.0. Subsequently the apoenzyme was eluted from affinity matrix by 0.01 M phosphate buffer, pH 8.0, whereas under these conditions the intact enzyme could not be eluted. The whole enzyme activity applied could be restored by incubation of the eluted apoenzyme with FAD. The binding strength of the apoenzyme to the immobilized steroid ligand is highly decreased in comparison to the native enzyme and can be interpreted by the action of rest hydrophobicity. That indicates the essential character of FAD for both ligand binding and transformation.

Steroidumwandelnde Enzyme aus Mikroorganismen X. Anreicherung einer 4‐En‐3‐oxosteroid‐5α‐Reduktase aus Mycobacterium smegmatis sowie Abtrennung und Anreicherung des Apoenzyms mit Hilfe der Affinitätschromatographie

Atrat

Deppmeyer

Groh

et al. 1979

Steroidumwandelnde Enzyme aus Mikroorganismen X. Anreicherung einer 4-En-3-oxosteroid-5oc-Reduktase aus Mycobacterium smegmatis sowie Abtrennung und Anreicherung des Apoenzyms mit Hilfe der Affinitatschromatographie P. ATRAT, V. DEPPMEYER, H. GROH und C. HORHOLD Technische Assistenz: L. MOLLER und U. TINNEY (Eingegangen a m 11. 8. 1978) The 4-en-3-oxosteroid-5a-reductase from Mycobacterium smegmatis mas bound biospecifically on the affinant containing an immobilized testosterone ligand. The enzyme obtained by elution with ethylene glycol and urea in a 32 fold purity has a S. A. of 8.73 x p~i androstenedione min-1 mg-'.The coenzyme (FAD) could be separated from the immobilized enzyme substrate complex on the affinity matrix, in the presence of (NH,),SO, a t p H 3.0. After elution of the apoenzyme 979, of the initial enzyme activity was obtained by incubation with FAD. The reactivated enzyme results in a 40 fold enrichment.