Objetivou-se avaliar a relação entre estresse ocupacional, burnout e cultura de segurança de profissionais da saúde de unidades de perioperatório. Estudo transversal, desenvolvido com profissionais de saúde de um hospital escola, do Rio Grande do Sul, Brasil. Utilizou-se um questionário contendo características biossociais e do trabalho; o Safety Attitudes Questionnaire, a Job Stress Scale e o Inventário Maslach de Burnout. Empregou-se análise estatística descritiva e inferencial. Os participantes avaliaram negativamente a cultura de segurança do paciente (média=63,8). Prevaleceu profissionais em trabalho de alta exigência (40,4%), com alto desgaste emocional (34,9%), alta despersonalização (44,5%) e alta realização profissional (40,4%). Observou-se correlação baixa e negativa entre despersonalização (p=-0,254), demanda psicológica (p=-0,246) e percepção da cultura de segurança. Ter realização profissional apresentou correlação baixa e positiva com a cultura de segurança (p=0,256). A ocorrência de estresse ocupacional e burnout possui correlação inversa e significativa com a cultura de segurança.