Mastitis subklinis pada kambing peranakan Ettawa (PE) merupakan penyakit yang merugikan secara ekonomi karena menurunkan produksi susu yang disebabkan oleh bakteri. Tujuan penelitian ini untuk mengisolasi bakteri penyebab mastitis subklinis pada kambing PE di Kemiri Kebo, Turi, Sleman, Yogyakarta. Sebanyak 24 sampel susu kambing mastitis subklinis digunakan dalam penelitian ini. Penentuan status mastitis subklinis pada kambing PE dengan uji CMT positif (++) atau (+++). Isolasi dan identifikasi bakteri secara konvensional berdasarkan reaksi biokimia. Mastitis subklinis pada kambing PE di Kemiri Kebo, Turi, Sleman, Yogyakarta disebabkan oleh Staphylococcus intermedius (38%), Staphylococcus aureus (32%), Staphylococcus epidermidis (25%), Staphylococcus hycus (12%), Streptococcus sp (22%), Corynebacterium sp (12%), Pseudomonas aeruginosa (18%), dan Escherichia coli (2%). Penelitian ini menunjukkan bahwa bakteri Gram positif lebih dominan sebagai penyebab mastitis subklinis pada kambing PE daripada Gram negatif.