Definición de las condiciones de temperatura y almacenamiento adecuadas en la detección de ADN de Leishmania por PCR en flebotominos.

Abstract

Para estudios epidemiológicos y programas de control de las leishmaniasis es importante la determinación taxonómica del insecto vector y del agente etiológico causante de esta enfermedad. Por su eficacia y sensibilidad, la utilización de técnicas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido avances en entomología médica. La metodología tradicional usada para la búsqueda de infección en los flebótomos es un método dispendioso que requiere mucho tiempo y capacitación para emitir un diagnóstico acertado. En el presente trabajo se evaluaron las condiciones y prácticas adecuadas para el almacenamiento de flebótomos con el propósito de aplicar la PCR. Hembras de Lutzomyia longipalpis de la colonia del Instituto Nacional de Salud se infectaron experimentalmente con una cepa de Leishmania chagasi del valle alto del río Magdalena (Quipile, Cundinamarca). Los insectos infectados se preservaron en tres soluciones: etanol al 100%, etanol al 70% y en buffer Tris-EDTA (TE); submuestras de cada una se almacenaron a -80 °C, -20 °C y a temperatura ambiente. Para determinar los porcentajes de infección, algunas de las hembras se disecaron para buscar las formas flageladas al microscopio. La extracción del K ADN se realizó con Chelex 100. Para la amplificación se utilizaron los iniciadores OL1 y OL2 de Leishmania con electroforesis en geles de agarosa al 1%. En cada una de las condiciones descritas se logró la amplificación de un fragmento de ≈120 pb, correspondiente a Leishmania spp. Estos resultados muestran la ventaja de incorporar como técnica de rutina la PCR para detectar flebótomos infectados de zonas endémicas de leishmaniasis visceral. Por costo-efectividad, se concluyó que las muestras entomológicas para estudios de incriminación vectorial utilizando la PCR, se pueden preservar a temperatura ambiente en etanol al 70%.Palabras clave: Lutzomyia, Leishmania, preservación, PCR, Chelex 100. Definition of temperature and storage adequate conditions in Leishmania DNA detection by PCR in phlebotomine samplesFor epidemiological studies and control programs of leishmaniasis, taxonomic identification of the etiologic agent of the disease in the insect vector is of critical importance. The implementation of molecular techniques such as the polymerase chain reaction (PCR) has permitted great advances in the efficacy and sensitivity of parasite identification. Previously, these investigations involved labor-intensive dissections and required expert personnel. The present work evaluates the effects of storage methods of phlebotomine samples in the optimization of PCR identification of Leishmania. Females of Lutzomyia longipalpis, from the colony of the Instituto Nacional de Salud, were experimentally infected with Leishmania chagasi (=L. infantum), from the upper Magdalena Valley (Quipile, Cundinamarca, Colombia). The infected insects were preserved in three solutions: 100% ethanol, 70% ethanol, and TE; subsamples of each class were stored at -80 °C, -20 °C and room temperature. To determine infection rat...

Seasonal variation and natural infection of Lutzomyia antunesi (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae), an endemic species in the Orinoquia region of Colombia

“…DNA was extracted using the phenol-chloroform protocol described by Golczer and Arrivillaga (2008) and amplified by the protocol standardised by Cabrera et al (2002) using the Leishmania genus-specific OL1 and OL2 universal primers, which target kinetoplast minicircle DNA (Romero et al 2001). This test was only performed for Lutzomyia species that had a vector-related background.…”

Detection of Leishmania (V) guyanensis in Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) collected from Pecari tajacu

“…Se utilizó una PCR en cada muestra para detectar el ADN del cinetoplasto (kDNA) de Leishmania Para la identificación de Leishmania spp., se utilizó una PCR de fusión de alta resolución (HRM-PCR) con una concentración de 5 ng/µl de ADN y 0,7 µM de los cebadores OL1 -Directo 5´ GGG GAG GGG CGT TCT GCG AA 3´ y OL2-Reverso 5´CCG CCC CTA TTT TAC ACC AAC CCC 3´ (12). La PCR-HRM consistió en 35 ciclos así: desnaturalización a 95 °C durante 10 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y una extensión a 72 °C durante 10 segundos, seguidos por un aumento progresivo de la temperatura de 1 °C en el intervalo de 75 a 95 °C para lograr la desnaturalización del amplicón de doble cadena y la disociación del fluoróforo (Eva Green, Qiagen).…”

Presencia en el peridomicilio de vectores infectados con Leishmania (Viannia) panamensis en dos focos endémicos en el occidente de Boyacá, piedemonte del valle del Magdalena medio, Colombia

“…La extracción del ADN de las biopsias de hámsteres inoculados y de los grupos de insectos se hizo con Chelex 100 ®, según el protocolo presentado por Cabrera et al (20). Se constituyó un banco de muestras con el ADN extraído de cada grupo y se almacenaron a -20°C hasta ser usados como plantilla para la PCR.…”