Os probióticos são utilizados há mais de 30 anos na aquicultura, no entanto, melhores resultados têm sido demonstrados usando cepas espécies-específicas, sustentando a premissa da não utilização de probióticos alóctones. Por este motivo, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial probiótico de cepas de bactérias ácido lácticas provenientes da microbiota intestinal de tambaqui. As bactérias isoladas foram identificadas de acordo com Vieira et al. (2013), através da reação de Gram, morfologia, produção de gás, catalase e hemólise, sendo testadas ainda quanto a sua resistência ao pH, a presença de sais biliares e NaCl, além do antagonismo frente à patógenos e perfil de resistência. Foram isoladas 28 cepas bacterianas, onde apenas quatro (CP03, CP08, CP10 e CP20) foram selecionadas na triagem inicial tendo como base as características das bactérias ácido lácticas. As cepas CP20 e CP03 foram as que melhor responderam aos testes de tolerância aos sais biliares, ao pH e à presença de NaCl respectivamente. A CP03 apresentou antagonismo apenas contra o Staphylococcus aureus e a CP08 e CP20 apresentaram antagonismo contra Escherichia coli, Vibrio harveyi, Pseudomonas aeroginosa e Aeromonas hydrophila. Apenas a CP03 e CP020 foram sensíveis a todos os antibióticos testados. As cepas bacterianas CP03 e CP020 exibiram propriedades probióticas significativas, apresentando boa viabilidade aos testes de resistência in vitro, assim como capacidade inibitória de patógenos. Dessa maneira sendo recomendadas como possível probiótico multiespécie.