The search for more pH stable stationary phases for high performance liquid chromatography

Abstract

As separações por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) são realizadas, na maioria das vezes, em condições de fase reversa empregando fases estacionárias a base de sílica. Um problema sério com estas fases reversas é a tendência da sílica dissolver em soluções de pH elevado, frequentemente necessárias para separar compostos básicos. A literatura reporta várias maneiras diferentes de tentar solucionar este problema. Este artigo relata os resultados obtidos com fases estacionárias desenvolvidas no nosso laboratório, utilizando suportes de sílica, contendo uma camada de um óxido metálico (zircônia ou titânia) ligada à sua superfície, seguido por imobilização de um polissiloxano ou por organofuncionalização com um trimetóxialquilsilano. Testes de estabilidade, também desenvolvidos no nosso laboratório, indicaram que a camada de óxido metálico aumenta o tempo de vida da coluna cromatográfica, por tornar a fase estacionária menos susceptível à dissolução. High performance liquid chromatographic (HPLC) separations are largely carried out using reversed phase conditions with stationary phases based on silica. A serious problem with these stationary phases is the tendency of silica to dissolve in high pH solutions often needed to separate basic compounds. The literature reports many different ways that have been tried to resolve this problem. This paper reports the results obtained in our laboratory with stationary phases prepared using silica supports having a layer of a metal oxide (zirconia or titania) attached on their surfaces, followed by immobilization of a polysiloxane or by organofunctionalization with a trimethoxyalkylsilane. Stability tests, also developed in our laboratory, indicate that the metal oxide layer increases the HPLC column lifetimes by making the stationary phase less susceptible to dissolution.

State-of-the-art in immobilized polymer stationary phases for high-performance liquid chromatography

“…92 Metalized silica supports provided a significant improvement in the chemical stability of immobilized polymer stationary phases, equating them to the stability of commercial stationary phases. 109 However, the immobilization of polymer does not result in a uniform polymeric layer over the entire silica surface including in all the pores. Some OH groups (from silica and/or from metal oxides) remain exposed.…”

O desafio de analisar solutos básicos por cromatografia líquida em modo reverso: algumas alternativas para melhorar as separações

“…Os mesmos silanóis que interagem com solutos básicos são os responsáveis pela instabilidade da sílica em meio alcalino, uma vez que os hidróxidos na fase móvel atacam os silanóis residuais, ocasionando a dissolução da sílica e a degradação da fase estacionária. 5,6,9,37,38,[72][73][74][75] Por sua vez, a sílica é um material extremamente estável em meio ácido, mas as ligações siloxano no ligante utilizado para modificar a sílica quimicamente (Si-C) são hidrolisadas em meio ácido. 5,6,9,37,38, 75,76 Estabilidade em fase móvel alcalina Os testes de estabilidade são feitos em condições semelhantes às condições comumente usadas (pH da fase aquosa entre 2 e 8, concentração de tampão entre 5 e 25 mmol/L e temperaturas entre 20 e 40 °C) ou em condições extremas para acelerar a degradação da fase estacionária (pH da fase aquosa extremamente ácido em 0,5 a 1,5 ou extremamente alcalino em 10 a 14, concentração de tampão de 50 a 200 mmol/L e temperaturas entre 23 e 150 °C), sendo que o primeiro caso representa melhor a estabilidade das fases estacionárias.…”

“…5,6,9,37,38, 75,76 Estabilidade em fase móvel alcalina Os testes de estabilidade são feitos em condições semelhantes às condições comumente usadas (pH da fase aquosa entre 2 e 8, concentração de tampão entre 5 e 25 mmol/L e temperaturas entre 20 e 40 °C) ou em condições extremas para acelerar a degradação da fase estacionária (pH da fase aquosa extremamente ácido em 0,5 a 1,5 ou extremamente alcalino em 10 a 14, concentração de tampão de 50 a 200 mmol/L e temperaturas entre 23 e 150 °C), sendo que o primeiro caso representa melhor a estabilidade das fases estacionárias. A degradação da fase estacionária é avaliada em função da passagem de fase móvel pela coluna, sendo representada em volumes de coluna (Vc) ou pelo tempo em que a fase móvel passa pela coluna 5,6,37,38,75 Muitas tentativas foram feitas para aumentar a estabilidade das fases estacionárias em condições alcalinas. A primeira, consistiu em aumentar o recobrimento da sílica; porém, não é possível funcionalizar 100% dos silanóis da sílica, mesmo após sucessivas reações de capeamento.…”

“…Temperaturas iguais ou maiores a 60 °C aumentam a solubilidade da sílica na fase móvel, inclusive em meio neutro. 5,6,9,37,38,59,73,74 Por exemplo, quando a fase estacionária Zorbax Rx-C18 é submetida a um teste de estabilidade com a fase móvel acetonitrila:tampão fosfato (pH 7; 250 mmol/L) 20:80 (v/v), praticamente nenhuma sílica é dissolvida quando o teste é feito a 40 °C, enquanto o teste feito a 60 °C resulta em uma dissolução acentuada da fase estacionária (Figura 11S, material suplementar). 74 No entanto, esta fase estacionária pode ser submetida ao mesmo teste a 60 °C com uma concentração de tris de 50 mmol/L sem que qualquer dissolução na sílica seja evidenciada; quando a concentração de tampão tris é aumentada para 250 mmol/L, a sílica começa a se dissolver, mas muito menos que nos testes que utilizavam fosfato a 50 e 250 mmol/L (Figura 12S, material suplementar).…”

“…1,2 Por sua vez, mais de 70% dos fármacos disponíveis no mercado são bases e a RP-LC é a técnica mais utilizada para analisar solutos básicos, 1,3 mas alguns problemas acontecem quando solutos básicos são analisados por RP-LC e, por esta razão, esta revisão se dedica a apresentar estes problemas e a fornecer algumas alternativas para superá-los, contribuindo com outras revisões produzidas pelo nosso grupo de pesquisa a respeito da RP-LC. [4][5][6][7][8][9] Em RP-LC o principal objetivo é obter separação dos solutos, que é avaliada através da resolução (R s ), que determinada o grau de separação entre dois picos adjacentes. A resolução pode ser expressa em função da eficiência (N 2 ), da seletividade (α) e do fator de retenção do segundo pico (k 2 ), com a aproximação de que ambos os picos têm aproximadamente a mesma largura à meia altura.…”