Possibilidades e limitações no uso da temperatura em cromatografia líquida de fase reversa

Abstract

Recebido em 16/9/09; aceito em 30/11/09; publicado na web em 8/4/10 POSSIBILITIES AND LIMITATIONS OF USING TEMPERATURE IN REVERSED PHASE LIQUID CHROMATOGRAPHY. High-temperature liquid chromatography (HTLC) is a technique that presents a series of advantages in liquid phase separations, such as: reduced analysis time, reduced pressure drop, reduced asymmetry factors, modified retentions, controlled selectivities, better efficiencies and improved detectivities, as well as permitting green chromatography. The practical limitations that relate to instrumentation and to stationary phase instability are being resolved and this technique is now ready to be applied for routine determinations.Keywords: high temperature liquid chromatography; stationary phase stability; green chromatography. INTRODUÇÃOO termo alta temperatura em cromatografia líquida (High Temperature Liquid Chromatography, HTLC) se refere ao uso de temperaturas entre 40 a 200 o C. O uso da temperatura como variável em cromatografia líquida é recente, embora Antia e Horvath 1 tenham descrito seu uso em 1988. A principal vantagem desta técnica é a redução no tempo de análise, característica que é de grande interesse prático para os usuários de cromatografia. Mas até o momento, esta técnica reside quase exclusivamente no meio acadêmico por causa de algumas limitações, como a falta de instrumentação específica para tal fim e a instabilidade das fases estacionárias. Desta forma, esta revisão se dedica à discussão das vantagens e limitações desta técnica, bem como os avanços recentes quanto à instrumentação e fases estacionárias, os quais devem impulsionar a migração desta técnica para o meio industrial. ASPECTOS TEÓRICOS Influência da temperatura sobre a pressãoA pressão gerada pela passagem de fase móvel (FM) por uma coluna pode ser descrita pela equação de Kozeny-Carman:2,3 ΔP = (ηFL)/(K 0 πr 2 dp 2 ), onde K 0 é a permeabilidade específica, η é a viscosidade da FM, F é a vazão da FM, r é o raio interno da coluna e dp é o diâmetro médio das partículas da fase estacionária (FE) que recheiam a coluna. A viscosidade decresce exponencialmente em função da temperatura, 2,3 assim, o aumento da temperatura permite: a utilização de maiores vazões; o emprego de partículas com menores diâmetros; a utilização de colunas com maior comprimento ou conectadas em série.Um exemplo de como o aumento da temperatura permite o uso de maiores vazões é o trabalho de Yang et al.2 onde uma coluna ZirChrom-PS (50 x 4,6 mm, dp 2,5 μm) utilizada a 25 o C e com FM acetonitrila:água, 25:75 v/v, a uma vazão de 2 mL/min gera uma pressão de 400 bar, alcançando o limite máximo de pressão de um sistema convencional de cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Quando a temperatura é elevada a 150 o C, a pressão é reduzida a 60 bar, permitindo o uso de uma vazão de 14 mL/min sem exceder o limite de pressão da bomba.As micropartículas (dp < 2 μm) têm pequena resistência à transferência de massa a altas vazões. Por isso podem ser utilizadas com pouc...

Enzimas Vegetais: Extração E Aplicações Biotecnológicas

“…Levando em consideração as vantagens e aplicabilidade do método, a cromatografia em fase reversa em comparação com a interação hidrofóbica, apresenta uma matriz cromatográfica com alta hidrofobicidade (56). Com isso, a utilização de solventes orgânicos pode levar à desnaturação da proteína de interesse durante a cromatografia, sendo considerada a grande desvantagem da metodologia, por isso, este tipo de cromatografia não se aplica a um grande número de casos (57).…”

“…Posteriormente, o extrato proteico é aplicado à coluna. Todas as proteínas com afinidade para o ligante ficarão retidas na coluna e as outras proteí-nas passarão através da coluna sem qualquer tipo de interação (56).…”

O desafio de analisar solutos básicos por cromatografia líquida em modo reverso: algumas alternativas para melhorar as separações

“…Os mesmos silanóis que interagem com solutos básicos são os responsáveis pela instabilidade da sílica em meio alcalino, uma vez que os hidróxidos na fase móvel atacam os silanóis residuais, ocasionando a dissolução da sílica e a degradação da fase estacionária. 5,6,9,37,38,[72][73][74][75] Por sua vez, a sílica é um material extremamente estável em meio ácido, mas as ligações siloxano no ligante utilizado para modificar a sílica quimicamente (Si-C) são hidrolisadas em meio ácido. 5,6,9,37,38, 75,76 Estabilidade em fase móvel alcalina Os testes de estabilidade são feitos em condições semelhantes às condições comumente usadas (pH da fase aquosa entre 2 e 8, concentração de tampão entre 5 e 25 mmol/L e temperaturas entre 20 e 40 °C) ou em condições extremas para acelerar a degradação da fase estacionária (pH da fase aquosa extremamente ácido em 0,5 a 1,5 ou extremamente alcalino em 10 a 14, concentração de tampão de 50 a 200 mmol/L e temperaturas entre 23 e 150 °C), sendo que o primeiro caso representa melhor a estabilidade das fases estacionárias.…”

“…Temperaturas iguais ou maiores a 60 °C aumentam a solubilidade da sílica na fase móvel, inclusive em meio neutro. 5,6,9,37,38,59,73,74 Por exemplo, quando a fase estacionária Zorbax Rx-C18 é submetida a um teste de estabilidade com a fase móvel acetonitrila:tampão fosfato (pH 7; 250 mmol/L) 20:80 (v/v), praticamente nenhuma sílica é dissolvida quando o teste é feito a 40 °C, enquanto o teste feito a 60 °C resulta em uma dissolução acentuada da fase estacionária (Figura 11S, material suplementar). 74 No entanto, esta fase estacionária pode ser submetida ao mesmo teste a 60 °C com uma concentração de tris de 50 mmol/L sem que qualquer dissolução na sílica seja evidenciada; quando a concentração de tampão tris é aumentada para 250 mmol/L, a sílica começa a se dissolver, mas muito menos que nos testes que utilizavam fosfato a 50 e 250 mmol/L (Figura 12S, material suplementar).…”

“…1,2 Por sua vez, mais de 70% dos fármacos disponíveis no mercado são bases e a RP-LC é a técnica mais utilizada para analisar solutos básicos, 1,3 mas alguns problemas acontecem quando solutos básicos são analisados por RP-LC e, por esta razão, esta revisão se dedica a apresentar estes problemas e a fornecer algumas alternativas para superá-los, contribuindo com outras revisões produzidas pelo nosso grupo de pesquisa a respeito da RP-LC. [4][5][6][7][8][9] Em RP-LC o principal objetivo é obter separação dos solutos, que é avaliada através da resolução (R s ), que determinada o grau de separação entre dois picos adjacentes. A resolução pode ser expressa em função da eficiência (N 2 ), da seletividade (α) e do fator de retenção do segundo pico (k 2 ), com a aproximação de que ambos os picos têm aproximadamente a mesma largura à meia altura.…”