Isolamento e eficiência de plaqueamento de protoplastos de citros

Abstract

As recentes ferramentas biotecnológicas para o melhoramento in vitro de citros incluem a hibridação somática por fusão de protoplastos. A otimização dos protocolos de isolamento, plaqueamento e cultura de protoplastos, fundamental para maior eficiência na produção de híbridos somáticos, foi avaliada em 11 variedades cítricas. As soluções enzimáticas testadas foram: 1. celulase Onozuka RS, 1%; macerase R-10, 1%, pectoliase Y-23, 0,2%; 2. celulase Onozuka R-10, 0,2 %; macerase R-10, 0,3%; driselase, 0,1%; 3. celulase Onozuka R-10, 1%; macerase R-10, 0,2%; driselase, 0,1%. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado em meio de cultura EME 0,7 M, nas densidades de 2 x 10(4); 5 x 10(4); 10(5); 2 x 10(5) e 3 x 10(5) protoplastos.mL-1, no escuro, a 25 ± 1°C. A solução enzimática 1 possibilitou melhor rendimento no isolamento de protoplastos para a maioria das variedades, exceto para o limão-'Cravo', onde o melhor rendimento foi obtido na solução enzimática 3, e para as laranjas-doces 'Valência' e 'Succari', que apresentaram maiores rendimentos na solução enzimática 2. A eficiência final de plaqueamento, avaliada aos 90 dias de cultivo, foi superior nas densidades de 10(5) e 2 x 10(5) protoplastos.mL-1, para todas as variedades. O desenvolvimento de embriões somáticos foi observado em todas as variedades, exceto para tangor 'Murcote'.

Eficiência de isolamento e de plaqueamento de protoplastos de laranja-doce

“…Essas influências das diferentes cultivares dentro de uma mesma espécie cítrica e da solução enzimática no isolamento de protoplastos já foram constatadas anteriormente por outros autores (OLIVEIRA et al, 1994;MENDES-DA-GLÓRIA et al, 2000b;COSTA et al, 2002). Estas diferenças estão relacionadas com características inerentes à parede celular, que, embora seus constituintes básicos sejam os mesmos, sua composição pode variar muito entre as espécies e cultivares (CARNEIRO et al, 1998).…”

“…Estes resultados discordam daqueles relatados por Costa et al (2002), que, avaliando cinco densidades de plaqueamento de protoplastos, verificaram formação de um maior número de microcolônias nas densidades de 1 x 10 5 e 2 x 10 5 protoplastos.mL -1 , o que foi constatado pela eficiência de plaqueamento tanto para as cultivares de tangerinas avaliadas (tangerina 'Cleópatra', com eficiência de 9,8% na densidade de 2 x 10 5 protoplastos.mL -1 ), quanto para as laranjas ('Ruby Blood' e 'Valência' com eficiência de 9,0% e 8,5%, respectivamente, na densidade de 2 x 10 5 protoplastos.mL -1 ). Para os mesmos autores, o incremento na densidade de 3 x 10 5 protoplastos.mL -1 não demonstrou comportamento linear, e as poucas colônias desenvolvidas cessaram o crescimento e morreram 90 dias após o início do cultivo.…”

“…Costa et al (2002) também observaram uma baixa eficiência de plaqueamento nessas duas densidades para todas as espécies cítricas e cultivares estudadas. As células estimulam a divisão mitótica de células adjacentes liberando fatores de crescimento, incluindo aminoácidos no meio ao seu redor.…”

“…Os principais fatores que determinam a eficiência de isolamento de protoplastos estão relacionados ao genótipo, estado fisiológico das células, tipo e concentração de enzimas e estabilizadores osmóticos, tempo de incubação na solução enzimática, agitação, luminosidade e temperatura (CARNEIRO et al, 1998;COSTA et al, 2002).…”

“…A densidade final de protoplastos no meio de cultura (densidade de plaqueamento) é crucial para maximizar a regeneração da parede celular vegetal e, concomitantemente, a formação de células-filhas. Costa et al (2002) avaliaram o efeito de diferentes densidades de cultivo na eficiência final de plaqueamento para diversas variedades cítricas e verificaram a formação de um maior número de microcolônias nas densidades de 10 5 e 2 x 10 5 protoplastos.mL -1 . Segundo Evans e Bravo (1983), para cada espécie, há uma densidade, mínima de plaqueamento na qual não ocorre divisão celular.…”