Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Fitotecnia Piracicaba 2009 Piracicaba Aos meus queridos pais Maria Cristina e Nelson, por todo o apoio e compreensão, e aos meus avós Martha e Wilson (in memorian), Dalvina (in memorian) e Cícero (in memorian). OFEREÇO Ao meu namorado Patrick, por todo o carinho e incentivo; às minhas irmãs Letícia e Luiza pelo companheirismo. DEDICO 4 5 AGRADECIMENTOS Agradeço a meus queridos pais pelo apoio, força e compreensão. Às minhas irmãs pelo companheirismo. Ao meu namorado Patrick Marques Dourado pelo carinho e incentivo. Ao professor Drº Francisco de Assis Alves Mourão Filho pela orientação, pelo crédito, pela oportunidade concedida para a realização do estágio de prática profissionalizante e do mestrado e pelos ensinamentos. À professora Drª Beatriz Januzzi Mendes pela colaboração e sugestões. Ao professor Drº Paulo Hercilio Viegas Rodrigues pelas idéias, apoio e amizade. Aos professores da dos Programas de Pós-Graduação da ESALQ pelos conhecimentos transmitidos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudos. Ao Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus) pelo apoio financeiro a este trabalho. Aos colegas do Fabiana pelo apoio, momentos de descontração e um ótimo convívio, e em especial à Luzia, pela sinceridade, amizade, palavras de conforto e auxílio nas horas difíceis. Aos colegas que já passaram pelo Laboratório, Suane, Rosely, Gustavo, Amâncio, Waner Júnior e Jannayna pela convivência. ABSTRACT Isolation, protoplast culture and regeneration of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck)Plant regeneration, by organogenesis or somatic embryogenesis from cell cultures and in vitro plant tissue culture is the basis for the use of biotechnology in plant breeding. Studies were conducted with five cultivars of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), "Pêra", "Natal", "Lima Verde", "Hamlin" and "Westin". This work aimed to evaluate the isolation efficiency of protoplasts, to evaluate platting efficiency of protoplasts based on five densities of cells and different culture media and to evaluate somatic embryogenesis based on culture medium composition and concentration. The enzymatic solutions tested were: 1. Grosser and Chandler (1987): 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha) and 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser and Chandler (1987) modified: 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult) and 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Enzimatic solution containing 4% cellulase Onozuka R-10 (Yakult) and 1% macerase R-10. Protoplasts were cultured at densities of 2 x 10 4 ; 5 x 10 4 ; 10 5 ; 2 x 10 5 e 3 x 10 5 protoplasts.mL -1 in EME 0,7M, BH 3 0,7M and BH3 + EME 0,7M, in the dark, at 25 ± 1 ºC. The enzymatic solution 2 provided higher yield for the cultivars "Hamlin", "Natal" and "Pêra", and enzymatic solution 1 resulted in better protoplast isolation for cultivar "Westin". Final platting efficiency, evaluated 90 days after culture, was higher ...
A produção de flores constitui-se em enorme potencial ao <i>Agribusiness</i> brasileiro. No entanto, para se ter acesso ao competitivo mercado de flores, é necessário vencer algumas barreiras. Uma das encontradas para a expansão de algumas espécies ornamentais, a exemplo de <i>Zantedeschia</i> spp., é a inexistência de protocolos eficientes de micropropagação visando à produção de mudas sadias em escala comercial e a um preço competitivo. O objetivo deste trabalho foi desenvolver protocolo específico para micropropagação da cultivar Neroli tendo em vista a otimização do processo produtivo para ganho de escala e qualidade fitossanitária das mudas obtidas. Para tanto, utilizaram-se os seguintes sistemas de esterilização de meios de cultura: a) sistema tradicional com o uso de autoclave e frascos de vidro como recipientes e b) sistema semi-automatizado no qual o meio de cultura é esterilizado em máquina especial (esterilizador de meio de cultura) e distribuído em dois diferentes potes de plástico esterilizados por plasma: 1) com filtro inserido na tampa e 2) sem filtro inserido na tampa. Compararam-se protocolos de esterilização dos explantes, método de isolamento dos explantes meristemáticos, composição nutricional e composição de fitorreguladores dos meios de cultura. O desenvolvimento do sistema semi- automatizado proposto combinado com 4,44 µM de benzilaminopurina (BAP) e uso de potes plásticos com filtro inserido nas tampas aumentaram a eficiência da micropropagação mensurada pelo comprimento médio das plântulas (5,75 ± 0,22), pelo número médio de brotos obtidos por explantes (2,56 ± 0,25) e pelo número médio de raízes (7,22 ± 0,31). O protocolo obtido pode auxiliar na redução dos custos desta ornamental, viabilizando-a comercialmente.
O isolamento e plaqueamento de protoplastos são fatores fundamentais para o sucesso no cultivo in vitro deste tipo de explante visando a manipulações genéticas. A composição da solução enzimática no isolamento, a densidade de cultivo, bem como o próprio genótipo utilizado são variáveis importantes nestas etapas. Desta forma, o objetivo do trabalho foi avaliar a eficiência de isolamento de protoplastos em função de três soluções enzimáticas e a eficiência de plaqueamento em função de cinco densidades de protoplastos e diferentes composições de meio de cultura em cultivares de laranja-doce. As soluções enzimáticas avaliadas para o isolamento de protoplastos foram: 1. celulase Onozuka RS 1%, macerase R-10 1% e pectoliase 0,2%; 2. celulase Onozuka RS 1%, macerase R-10 1% ; 3. celulase Onozuka R-10 4%, macerase R-10 1%. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado nas densidades de 2 x 10(4); 5 x 10(4); 10(5); 2x 10(5) e 3 x 10(5) protoplastos.mL-1, nos meios de cultura EME 0,7M, BH3 0,7M e BH3 + EME 0,7M em ausência de luz, a 25 ± 1 ºC. A solução enzimática 2 proporcionou maior rendimento no isolamento de protoplastos das cultivares 'Hamlin', 'Natal' e 'Pera', e a solução enzimática 1 foi a mais adequada para a laranja 'Westin'. Para a cultivar 'Lima-Verde', a solução enzimática 3 foi a mais eficiente. A eficiência final de plaqueamento, avaliada aos 90 dias de cultivo, foi superior nas densidades de 3 x 10(5) e 2 x 10(5) protoplastos.mL-1 para as cultivares 'Hamlin', 'Natal' e 'Lima-Verde', e nas densidades de 2 x 10(5) e 10(5) protoplastos.mL-1 para a laranja 'Westin'.
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