The present study was carried out to assess the detection sensitivity of four microbial inhibition assays (MIAs) in comparison with the results obtained by the High Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection (HPLC-DAD) method for antibiotics of the β-lactam group and chloramphenicol in fortified raw milk samples. MIAs presented fairly good results when detecting β-lactams, whereas none were able to detect chloramphenicol at or above the permissible limits. HPLC analysis revealed high recoveries of examined compounds, whereas all detection limits observed were lower than their respective maximum residue limits (MRL) values. The extraction and clean-up procedure of antibiotics was performed by a modified matrix solid phase dispersion procedure using a mixture of Plexa by Agilent and QuEChERS as a sorbent. The HPLC method developed was validated, determining the accuracy, precision, linearity, decision limit, and detection capability. Both methods were used to monitor raw milk samples of several cows and sheep, obtained from producers in different regions of Greece, for the presence of examined antibiotic residues. Results obtained showed that MIAs could be used effectively and routinely to detect antibiotic residues in several milk types. However, in some cases, spoilage of milk samples revealed that the kits’ sensitivity could be strongly affected, whereas this fact does not affect the effectiveness of HPLC-DAD analysis.

No abstract

No abstract

No abstract

Despite the intensive implementation of control programmes goat, sheep and human brucellosis remains endemic in Greece. As the discrimination between field endemic strains and vaccine strain Rev.1 is not feasible, it is essential to develop new diagnostic tools for brucellosis diagnosis. Moreover, effective disease control requires enhanced epidemiological surveillance in both humans and animals including robust laboratory support. Two new multiplex (duplex) polymerase chain reactions (PCRs) were developed and the results were compared with those obtained by real‐time PCR and bacteriological biotyping. A total of 71 Brucella spp. Greek endemic strains were identified at species and biovar level, using both molecular and conventional techniques. Their discrimination from the vaccine strain Rev.1 was achieved, using polymerase chain reaction‐restriction fragment length polymorphism assay (PCR‐RFLP). All 71 strains were identified as Brucella melitensis by multiplex PCR as well as by real‐time PCR and conventional biotyping. Sixty‐two (87.3%) out of 71 strains were identified as B. melitensis biovar 3, eight (11,3%) strains as biovar 1 and only one (1,4%) as biovar 2. Digestion with PstI restriction enzyme revealed that all strains were field endemic strains, as they gave different patterns from the vaccine strain Rev.1. Brucella melitensis biovar 3 appears to be the predominant type in Greece. The novel multiplex PCR produced results concordant to ones obtained by real‐time PCR and conventional biotyping. This technique could support and facilitate the surveillance of Brucellosis in Greece contributing in the control of the disease.

ABSTRACT. Scrapie is a slowly progressive infectious disease of sheep and goats that causes degeneration of the central nervous system. Scrapie is one of several transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), like the bovine spongiform encephalopathy (BSE). In sheep, polymorphisms at codons 136, 154 and 171 of the host gene PRPN that encodes the PrP protein, are known to be closely linked to susceptibility or resistance to natural and experimental classical scrapie. In many countries, but not in Greece, breeding programs have been implemented to increase genetic resistance. This study was supported mainly by the private initiatives of farmers willing to improve their flocks by increasing the resistance to scrapie. Thus, the PrP genotypes (of the three mentioned codons) from 5815 blood samples of clinically healthy rams from 160 healthy flocks during the period 2012 -2016 were determined. Additionally, 1399 blood samples were genotyped only for the 171 codon. Samples were analyzed by Real Time PCR (TaqMan probes) with specific labeled probes. Our results showed an increased percentage of the two genotypes, ARR/ARR and ARR/ ARQ linked with resistance to the disease (27.29% and 34.6%, respectively) and relatively reduced percentage of the genotype ARQ/ARQ (24.23%) which is associated with susceptibility to disease and is the most common genotype in the Greek flocks. This joined effort has resulted in the establishment of an important number of farms with an increased population of genetically resistant rams to classical scrapie.

Η βρουκέλλωση αποτελεί μία από τις συχνότερες ζωονόσους στην Ελλάδα. Παρά τη συστηματική εφαρμογή προγραμμάτων αντιμετώπισης από το 1975, η νόσος εξακολουθεί να ενδημεί στην Ελλάδα με σοβαρές επιπτώσεις στη Δημόσια Υγεία και την κτηνοτροφία. Η συχνή υπο-δήλωση του νοσήματος, η εμφάνιση διασταυρούμενων αντιδράσεων με τη χρήση των υπαρχουσών μεθόδων στην καθημερινή διάγνωση της βρουκέλλωσης και η αδυναμία διάκρισης του εμβολιακού στελεχους Rev-1 από τα φυσικά μολυσματικά στελέχη B. melitensis με τις συμβατικές τεχνικές αποτελούν μερικά από τα σημαντικότερα προβλήματα των προγραμμάτων επιτήρησης και αντιμετώπισης της νόσου.Τα τελευταία χρόνια, η φασματομετρία χρόνου πτήσης με Ιοντισμό Εκρόφησης με Λέιζερ Υποβοηθούμενο από τη Μήτρα (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry - MALDI-TOF MS) αποτελεί μία πολλά υποσχόμενη τεχνική για εφαρμογή στη διάγνωση της βρουκέλλωσης. Η μέθοδος έχει την ικανότητα να ταυτοποιεί μικροοργανισμούς συγκρίνοντας το πρωτεϊνικό τους προφίλ με τα πρωτεϊνικά φάσματα βιβλιοθηκών αναφοράς. Αν και πλεονεκτεί έναντι των υπόλοιπων διαγνωστικών τεχνικών, η εφαρμογή της μεθόδου MALDI-TOF MS στη διάγνωση της βρουκέλλωσης παραμένει ακόμα σχετικά περιορισμένη, γεγονός που οφείλεται κυρίως στις μη πλήρως ενημερωμένες βάσεις δεδομένων λόγω της ενδεχόμενης χρήσης του μικροοργανισμού ως βιολογικό όπλο.Σε αντίθεση με άλλα βακτήρια, η ταυτοποίηση των βρουκελλών σε επίπεδο βιότυπου είναι εξαιρετικά δύσκολη εξαιτίας της μεγάλης γενωμικής ομολογίας μεταξύ των ειδών του γένους. Μέχρι σήμερα, πολλοί ερευνητές προσπάθησαν να τυποποιήσουν τις βρουκέλλες με τη μέθοδο MALDI-TOF MS σημειώνοντας φτωχά αποτελέσματα. Επιπλέον, δε γνωρίζουμε καμία μελέτη που να έχει εξετάσει τη δυνατότητα της μεθόδου στη διάκριση του εμβολιακού στελέχους Rev-1 από φυσικά μολυσματικά στελέχη B. melitensis. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να δημιουργηθεί μία βάση δεδομένων ώστε να αξιολογηθεί η μέθοδος MALDI-TOF MS ως προς την ταυτοποίηση των βρουκελλών σε επίπεδο είδους, ενώ μέσω του προσδιορισμού αξιόπιστων κορυφών - βιοδεικτών να συμβάλει στην τυποποίηση των στελεχών B. melitensis και τη διάκριση των φυσικά μολυσματικών στελεχών B. melitensis από το εμβολιακό στέλεχος Rev-1.Απομονώθηκαν εβδομήντα πέντε στελέχη Brucella spp. από ασθενείς και ζώα σε τέσσερα γεωγραφικά διαμερίσματα της Ελλάδας κατά τη χρονική περίοδο 1999-2018. Η ταυτοποίηση των στελεχών σε επίπεδο είδους και βιότυπου βασίστηκε στη χρήση των μοριακών και βιοχημικών δοκιμών αντίστοιχα, ενώ η διάκριση των μολυσματικών στελεχών B. melitensis από το εμβολιακό στέλεχος Rev-1 προσεγγίστηκε με τη μεθοδολογία της PCR-RFLP. Στη συνέχεια, κατασκευάστηκε μία βιβλιοθήκη αναφοράς με σκοπό την ανάλυση όλων των στελεχών της μελέτης και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά των μοριακών και συμβατικών τεχνικών. H αξιολόγηση της MALDI-TOF MS στη διάκριση των βιότυπων της B. melitensis καθώς και στη διαφοροποίηση της εμβολιακής από τη φυσική λοίμωξη πραγματοποιήθηκε με την ενίσχυση της βιβλιοθήκης αναφοράς με επιπλέον φάσματα. Η επεξεργασία των φασμάτων για την ανίχνευση των βιοδεικτών πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πακέτο MALDIquant του λογισμικού Mass-Up. Από τα 75 στελέχη που αναλύθηκαν, η μέθοδος MALDI-TOF MS κατάφερε να ταυτοποιήσει 73 στελέχη (97,33%) ως B. melitensis και δύο στελέχη (2,67%) ως B. abortus, σημειώνοντας στην πλειοψηφία των στελεχών scores > 2.300. Τα αποτελέσματα ήταν 100% συγκρίσιμα με τα αποτελέσματα των μοριακών και βιοχημικών δοκιμών. Η ανάλυση των φασμάτων με το λογισμικό Mass-Up κατέδειξε συνολικά τέσσερις πρωτεϊνικές κορυφές (5207, 8026, 8038 και 9664 Da), που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί βιοδείκτες για τη διάκριση των βιότυπων της B. melitensis (p<0,05 και q<0,05). Μετά την ανεύρεση των βιοδεικτών, ακολούθησε η αναζήτησή τους στα προφίλ των 62 στελεχών που δε συμμετείχαν στην κατασκευή της βάσης δεδομένων. Tα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βιβλιοθήκη αναφοράς μπορεί να τυποποιήσει το 75,81% των στελεχών B. melitensis bv. 3. Αντίθετα, η διαχωριστική ικανότητα της μεθόδου δε μπόρεσε να εκτιμηθεί για τους άλλους δύο βιότυπους, καθώς τα μόνα διαθέσιμα στελέχη αξιοποιήθηκαν στην κατασκευή της βάσης. Από τη σύγκριση των πρωτεϊνικών προφίλ των φυσικά μολυσματικών στελεχών B. melitensis και των εμβολιακών στελεχών Rev-1 διαπιστώθηκε ότι υπάρχουν δύο στατιστικά σημαντικές κορυφές (3528 και 7328 Da) που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί βιοδείκτες για τη μεταξύ τους διάκριση (p<0,05 και q<0,05). Κατά την αναζήτηση των δεικτών αυτών στα φάσματα των στελεχών της μελέτης προέκυψε ότι 72 στελέχη (98,63%) ήταν φυσικά μολυσματικά, ενώ μόνο ένα στέλεχος (1,37%) ταυτοποιήθηκε ως εμβολιακό. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν σε απόλυτη συμφωνία με τα αποτελέσματα της μεθόδου PCR-RFLP.Η νέα βιβλιοθήκη αναφοράς μπορεί να ταυτοποιήσει τις βρουκέλλες σε επίπεδο είδους με υψηλή ακρίβεια προσφέροντας παράλληλα μία πιο οικονομική και γρήγορη επιλογή στη διαγνωστική προσέγγιση του νοσήματος. Η μέθοδος δεν επηρεάζεται από άλλους συγγενείς μικροοργανισμούς με το γένος Brucella, γεγονός που προσδίδει στη μέθοδο μία υπεροχή έναντι των ορολογικών δοκιμών. Επιπλέον, η ικανότητα της βιβλιοθήκης να διαφοροποιεί την εμβολιακή από τη φυσική λοίμωξη με τη χρήση ειδικών βιοδεικτών θεωρείται μείζονος σημασίας στα προγράμματα επιδημιολογικής επιτήρησης και ελέγχου της βρουκέλλωσης. Ωστόσο, η συνεχής διεύρυνση της βάσης με νέα φάσματα θεωρείται απαραίτητη για την αύξηση της δυναμικής της στην τυποποίηση των στελεχών B. melitensis και τη μελλοντική ευρεία εφαρμογή της μεθόδου MALDI-TOF MS στην καθημερινή κλινικο-εργαστηριακή πράξη.

The objective of this study was to assess the detection sensitivity of four commercial microbial inhibition assays (MIAs) in comparison with the results by High Pressure Liquid Chromatography with Diode Array Detection (HPLC-DAD) for residues of three tetracyclines, trimethoprim and sulfadiazine in fortified raw milk samples. MIAs showed fairly good results at detecting sulfadiazine residues, whereas concerning tetracyclines and trimethoprim residues, most of the kits showed insufficient results. HPLC analysis revealed high recoveries of examined compounds with detection limits below their respective maximum residue levels (MRLs). The HPLC method was validated determining linearity, accuracy, precision, detection capability and decision limit. Subsequently, both methods were used to monitor several cow and sheep milk samples for the presence of antibacterial agents. Results obtained showed that MIAs could be successfully used for the analysis of different milk types. However, milk spoilage which was observed in some cases could decrease the sensitivity of the kits, a fact that does not seem to influence the effectiveness of HPLC-DAD method.<br /><br />