Αναζήτηση της δυνατότητας αξιοποίησης της αναλυτικής μεθόδου MALDI-TOF στην τυποποίηση Β.melitensis σε δείγματα ανθρώπων, αιγών, προβάτων και γάλακτος

Abstract

Η βρουκέλλωση αποτελεί μία από τις συχνότερες ζωονόσους στην Ελλάδα. Παρά τη συστηματική εφαρμογή προγραμμάτων αντιμετώπισης από το 1975, η νόσος εξακολουθεί να ενδημεί στην Ελλάδα με σοβαρές επιπτώσεις στη Δημόσια Υγεία και την κτηνοτροφία. Η συχνή υπο-δήλωση του νοσήματος, η εμφάνιση διασταυρούμενων αντιδράσεων με τη χρήση των υπαρχουσών μεθόδων στην καθημερινή διάγνωση της βρουκέλλωσης και η αδυναμία διάκρισης του εμβολιακού στελεχους Rev-1 από τα φυσικά μολυσματικά στελέχη B. melitensis με τις συμβατικές τεχνικές αποτελούν μερικά από τα σημαντικότερα προβλήματα των προγραμμάτων επιτήρησης και αντιμετώπισης της νόσου.Τα τελευταία χρόνια, η φασματομετρία χρόνου πτήσης με Ιοντισμό Εκρόφησης με Λέιζερ Υποβοηθούμενο από τη Μήτρα (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry - MALDI-TOF MS) αποτελεί μία πολλά υποσχόμενη τεχνική για εφαρμογή στη διάγνωση της βρουκέλλωσης. Η μέθοδος έχει την ικανότητα να ταυτοποιεί μικροοργανισμούς συγκρίνοντας το πρωτεϊνικό τους προφίλ με τα πρωτεϊνικά φάσματα βιβλιοθηκών αναφοράς. Αν και πλεονεκτεί έναντι των υπόλοιπων διαγνωστικών τεχνικών, η εφαρμογή της μεθόδου MALDI-TOF MS στη διάγνωση της βρουκέλλωσης παραμένει ακόμα σχετικά περιορισμένη, γεγονός που οφείλεται κυρίως στις μη πλήρως ενημερωμένες βάσεις δεδομένων λόγω της ενδεχόμενης χρήσης του μικροοργανισμού ως βιολογικό όπλο.Σε αντίθεση με άλλα βακτήρια, η ταυτοποίηση των βρουκελλών σε επίπεδο βιότυπου είναι εξαιρετικά δύσκολη εξαιτίας της μεγάλης γενωμικής ομολογίας μεταξύ των ειδών του γένους. Μέχρι σήμερα, πολλοί ερευνητές προσπάθησαν να τυποποιήσουν τις βρουκέλλες με τη μέθοδο MALDI-TOF MS σημειώνοντας φτωχά αποτελέσματα. Επιπλέον, δε γνωρίζουμε καμία μελέτη που να έχει εξετάσει τη δυνατότητα της μεθόδου στη διάκριση του εμβολιακού στελέχους Rev-1 από φυσικά μολυσματικά στελέχη B. melitensis. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να δημιουργηθεί μία βάση δεδομένων ώστε να αξιολογηθεί η μέθοδος MALDI-TOF MS ως προς την ταυτοποίηση των βρουκελλών σε επίπεδο είδους, ενώ μέσω του προσδιορισμού αξιόπιστων κορυφών - βιοδεικτών να συμβάλει στην τυποποίηση των στελεχών B. melitensis και τη διάκριση των φυσικά μολυσματικών στελεχών B. melitensis από το εμβολιακό στέλεχος Rev-1.Απομονώθηκαν εβδομήντα πέντε στελέχη Brucella spp. από ασθενείς και ζώα σε τέσσερα γεωγραφικά διαμερίσματα της Ελλάδας κατά τη χρονική περίοδο 1999-2018. Η ταυτοποίηση των στελεχών σε επίπεδο είδους και βιότυπου βασίστηκε στη χρήση των μοριακών και βιοχημικών δοκιμών αντίστοιχα, ενώ η διάκριση των μολυσματικών στελεχών B. melitensis από το εμβολιακό στέλεχος Rev-1 προσεγγίστηκε με τη μεθοδολογία της PCR-RFLP. Στη συνέχεια, κατασκευάστηκε μία βιβλιοθήκη αναφοράς με σκοπό την ανάλυση όλων των στελεχών της μελέτης και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά των μοριακών και συμβατικών τεχνικών. H αξιολόγηση της MALDI-TOF MS στη διάκριση των βιότυπων της B. melitensis καθώς και στη διαφοροποίηση της εμβολιακής από τη φυσική λοίμωξη πραγματοποιήθηκε με την ενίσχυση της βιβλιοθήκης αναφοράς με επιπλέον φάσματα. Η επεξεργασία των φασμάτων για την ανίχνευση των βιοδεικτών πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πακέτο MALDIquant του λογισμικού Mass-Up. Από τα 75 στελέχη που αναλύθηκαν, η μέθοδος MALDI-TOF MS κατάφερε να ταυτοποιήσει 73 στελέχη (97,33%) ως B. melitensis και δύο στελέχη (2,67%) ως B. abortus, σημειώνοντας στην πλειοψηφία των στελεχών scores > 2.300. Τα αποτελέσματα ήταν 100% συγκρίσιμα με τα αποτελέσματα των μοριακών και βιοχημικών δοκιμών. Η ανάλυση των φασμάτων με το λογισμικό Mass-Up κατέδειξε συνολικά τέσσερις πρωτεϊνικές κορυφές (5207, 8026, 8038 και 9664 Da), που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί βιοδείκτες για τη διάκριση των βιότυπων της B. melitensis (p<0,05 και q<0,05). Μετά την ανεύρεση των βιοδεικτών, ακολούθησε η αναζήτησή τους στα προφίλ των 62 στελεχών που δε συμμετείχαν στην κατασκευή της βάσης δεδομένων. Tα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βιβλιοθήκη αναφοράς μπορεί να τυποποιήσει το 75,81% των στελεχών B. melitensis bv. 3. Αντίθετα, η διαχωριστική ικανότητα της μεθόδου δε μπόρεσε να εκτιμηθεί για τους άλλους δύο βιότυπους, καθώς τα μόνα διαθέσιμα στελέχη αξιοποιήθηκαν στην κατασκευή της βάσης. Από τη σύγκριση των πρωτεϊνικών προφίλ των φυσικά μολυσματικών στελεχών B. melitensis και των εμβολιακών στελεχών Rev-1 διαπιστώθηκε ότι υπάρχουν δύο στατιστικά σημαντικές κορυφές (3528 και 7328 Da) που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί βιοδείκτες για τη μεταξύ τους διάκριση (p<0,05 και q<0,05). Κατά την αναζήτηση των δεικτών αυτών στα φάσματα των στελεχών της μελέτης προέκυψε ότι 72 στελέχη (98,63%) ήταν φυσικά μολυσματικά, ενώ μόνο ένα στέλεχος (1,37%) ταυτοποιήθηκε ως εμβολιακό. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν σε απόλυτη συμφωνία με τα αποτελέσματα της μεθόδου PCR-RFLP.Η νέα βιβλιοθήκη αναφοράς μπορεί να ταυτοποιήσει τις βρουκέλλες σε επίπεδο είδους με υψηλή ακρίβεια προσφέροντας παράλληλα μία πιο οικονομική και γρήγορη επιλογή στη διαγνωστική προσέγγιση του νοσήματος. Η μέθοδος δεν επηρεάζεται από άλλους συγγενείς μικροοργανισμούς με το γένος Brucella, γεγονός που προσδίδει στη μέθοδο μία υπεροχή έναντι των ορολογικών δοκιμών. Επιπλέον, η ικανότητα της βιβλιοθήκης να διαφοροποιεί την εμβολιακή από τη φυσική λοίμωξη με τη χρήση ειδικών βιοδεικτών θεωρείται μείζονος σημασίας στα προγράμματα επιδημιολογικής επιτήρησης και ελέγχου της βρουκέλλωσης. Ωστόσο, η συνεχής διεύρυνση της βάσης με νέα φάσματα θεωρείται απαραίτητη για την αύξηση της δυναμικής της στην τυποποίηση των στελεχών B. melitensis και τη μελλοντική ευρεία εφαρμογή της μεθόδου MALDI-TOF MS στην καθημερινή κλινικο-εργαστηριακή πράξη.