O sucesso de técnicas biotecnológicas no melhoramento in vitro de citros está condicionado à existência prévia de uma metodologia eficiente de regeneração de plantas. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um sistema para regeneração de plantas in vitro, via organogênese de tangerina Cleópatra (Citrus reshni Hort. Ex Tan.). Experimentos avaliando concentrações de BAP (benzilaminopurina) e condições de cultivo, posição e polaridade do segmento de epicótilo, no meio de cultura, foram desenvolvidos para maximizar a regeneração. Para a indução das brotações, segmentos de epicótilo (1,0 cm de comprimento) foram cultivados em meio de cultura MT (Murashige & Tucker, 1969). Após 45 dias, foram avaliados: percentual de explantes responsivos e nº. de gemas/ explante responsivo. Para enraizamento, foram utilizados os meios MT e MT/2, com ou sem ANA (ácido naftalenoacético) na concentração 1,0 mg L-1. Após 60 dias, avaliou-se o percentual de brotos que emitiram raízes. A máxima proliferação de gemas foi obtida em condições de escuro, por 30 dias, utilizando-se da concentração 2,0 mg L-1 de BAP. Não houve efeito significativo da posição do explante na resposta organogenética. Os segmentos apicais e mediais mostraram-se mais eficientes que os basais. A concentração de 1,0 mg L-1 de BAP com o cultivo em condições de escuro, por 30 dias, na fase de indução de brotações combinada com ausência de auxina no meio MT/2, na fase de indução de raízes, assegurou melhor índice de enraizamento dos brotos regenerados.

Resumo -O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo eficiente de regeneração de plantas in vitro, via organogênese em explante juvenil de laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck), para atender futuros trabalhos de transformação genética. Segmentos de epicótilo utilizados como explantes foram introduzidos em meio de cultura MT. A fim de maximizar a regeneração de plantas in vitro, foram realizados experimentos para avaliar as concentrações de BAP no meio de cultivo (0, 1, 2, 3 ou 4 mg L -1 ), tamanho (0,25, 0,5 ou 1 cm), polaridade (basal, medial e apical), posição (horizontal ou vertical), condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 horas e escuro por 30 dias) e seccionamento nas extremidades dos explantes, bem como melhores condições para garantir plantas enraizadas (meio MT, MT/2, com ou sem auxina e microenxertia). A combinação de 3 mg L -1 de BAP com segmentos de 0,25 cm de comprimento foi eficiente na resposta organogenética. Segmentos apicais e mediais apresentaram melhores resultados do que os basais. O cultivo dos segmentos na posição horizontal, em fotoperíodo de 16 horas, foi mais eficiente do que na posição vertical. Não houve melhora na indução da organogênese in vitro, quando foram seccionadas as extremidades dos explantes. A microenxertia assegurou 100% de brotos enraizados.Termos para indexação: Citrus sinensis, cultura de tecidos, explante juvenil, benzilaminopurina, microenxertia. Regeneration of 'Pera' sweet orange plants through in vitro organogenesisAbstract -The objective of this work was to establish an efficient protocol for in vitro regeneration of plants through organogenesis of sweet orange 'Pera' (Citrus sinensis L. Osbeck) juvenile explants, in order to give support for future studies of genetic transformation. Epicotyl segments used as explants were introduced in MT culture media. To maximize the regeneration of in vitro plants, experiments were performed to evaluate different concentrations of BAP in the culture media (0, 1, 2, 3 or 4 mg L -1 ), size (0.25, 0.5 or 1 cm), polarity (basal, medium, and apical), position (horizontal or vertical), luminosity conditions (photoperiod of 16 hours, and darkness for 30 days), and incision of the segment ends. In addition, better conditions for obtaining rooted plants (culture media MT, MT/2, with and without auxin and micrografting) were studied. The combination of 3 mg L -1 BAP with segments of 0.25 cm length was efficient for the organogenetic response. Segment apices and mediums were more efficient comparing to the basal parts. Culturing the segments in the horizontal position, with a photoperiod of 16 hours, was more efficient than in the vertical position. There was no improvement in the induction of in vitro organogenesis, when the explant ends were incised. Micrografting assured 100% of rooted shoots.

-In order to evaluate the formation of adventitious buds and in vitro regeneration of sour orange plants (Citrus aurantium L.) two organogenesis-inducing experiments were conducted. In the fi rst experiment, the induction and in vitro regeneration of adventitious buds were tested on epicotyl and internodal segments under the infl uence of BAP or KIN associated with NAA. The second experiment evaluated the in vitro regeneration of sour orange plants related to different explant types (epicotyls segments, internodal segments of in vitro germinated plantlets and internodal segments of greenhouse cultivated plants). Data collected on both experiments included the percentage of responsive explants (explants that formed buds), and the number of buds per explant. The addition of BAP showed the best organogenic response. In vitro germinated epicotyl segments and internodal segments are recommended as explants for sour orange in vitro organogenesis. Rooting of regenerated shoots was achieved without the need of auxin in the medium.

Organogênese in vitro em laranja azeda (Citrus aurantium L.) e transformação genética de limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck) e laranja 'Valência' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene da replicase do Marafivirus Rosely Pereira da Silva Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em Agronomia. Área de concentração: Fitotecnia Piracicaba 2008 Rosely Pereira da Silva Engenheiro Agrônomo Organogênese in vitro em laranja azeda (Citrus aurantium L.) e transformação genética de limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck) e laranja 'Valência' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene da replicase do Marafivirus Orientador: Prof. Dr. FRANCISCO DE ASSIS ALVES MOURÃO FILHO Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em Agronomia. Área de concentração: Fitotecnia Piracicaba 2008 Direi do Senhor: "Ele é o meu Deus, o meu refúgio, a minha fortaleza, e nele confiarei". (Salmo 91,2) Dedico Com muito amor: Aos meus pais José Carlos e Maria da Conceição E aos meus irmãos Genilda, Paulo, Adriana e Samuel Ofereço Ao meu noivo Luiz Carlos 4 AGRADECIMENTOS A Deus, por me possibilitar mais esta conquista, por me iluminar sempre e ouvir minhas orações e os anseios do meu coração.Aos meus amados pais por serem fontes inesgotáveis de muito amor, carinho e dedicação.Obrigada pelo apoio, incentivo e confiança em mim depositada.Aos meus queridos irmãos e familiares pelas palavras de conforto, pelo carinho, amizade e apoio constantes, pelas orações e por torcerem sempre por mim.Ao meu noivo Luiz Carlos Cruz Brito, pelo apoio incondicional às minhas decisões, pelo seu amor, carinho e compreensão.

In vitro organogenesis from adult tissue of 'Bahia' sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck). Abstract-Introduction. Plant regeneration from in vitro culture of adult citrus tissue may help in early evaluation of important horticultural characteristics of genetic material from breeding programs, which incorporate biotechnological tools. Our research aimed to optimize in vitro culture conditions that could lead to the maximum plant regeneration through organogenesis of 'Bahia' sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) in explants (internodes and foliar disc segments) collected from adult plants grown under greenhouse conditions. Materials and methods. Organogenesis was induced in internodes on DBA3 culture media supplemented with BAP at (0.0, 1.0, 2.0 and 3.0) mg•L-1 combined with NAA (0.5 mg•L-1), and in foliar discs on culture media with BAP at (0.0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0) mg•L-1 combined or not with NAA (0.5 mg.L-1). Results and discussion. The concentrations of (1.0, 2.0 or 3.0) mg•L-1 of BAP combined with 0.5 mg•L-1 of NAA induced in vitro organogenesis in internodes of 'Bahia' sweet orange. The use of foliar discs was not efficient for adventitious organogenesis. Brazil / Citrus sinensis / micropropagation / in vitro regeneration / explants / culture media / organogenesis Organogenèse in vitro de tissu de plants adultes d'oranger 'Bahia' (Citrus sinensis L. Osbeck). Résumé-Introduction. La régénération de plants adultes d'agrumes par culture in vitro de tissus peut aider à l'évaluation précoce d'importantes caractéristiques horticoles de matériel issu de programmes d'amélioration génétique utilisant des outils de biotechnologie. Nos recherches ont cherché à optimiser les conditions de culture in vitro qui pourraient mener à une régénération maximale de plants par organogenèse d'oranger 'Bahia' (C. sinensis L. Osbeck) à partir d'explants (segments d'entre-noeuds et disques foliaires) prélevés sur des plantes adultes cultivées sous serre. Matériel et méthodes. Une organogenèse a été induite à partir d'explants d'entre-noeuds sur des milieux de culture DBA3 additionnés de BAP à (0,0, 1,0, 2,0 et 3,0) mg•L-1 , combinée à de l'ANA à 0,5 mg•L-1 , et à partir d'explants de disques foliaires sur milieux de culture avec BAP (0,0, 0,5, 1,0, 1,5 et 2.0) mg•L-1 , combinée ou pas avec de l'ANA (0,5 mg•L-1). Résultats et discussion. Les concentrations à (1,0, 2,0 ou 3.0) mg•L-1 de BAP combinée à 0.5 mg•L-1 d'ANA ont induit une organogenèse in vitro pour les explants d'entre-noeuds d'oranger 'Bahia'. L'utilisation des explants de disques foliaires n'a pas été efficace pour induire une organogenèse adventice. Brésil / Citrus sinensis / micropropagation / régénération in vitro / explant / milieu de culture / organogenèse

Resumo -O objetivo deste trabalho foi avaliar a indução e a formação de gemas adventícias em explantes de laranja-azeda, pelo uso de fi torreguladores. Em experimentos de organogênese in vitro foram avaliados 6-benzilaminopurina (BAP), thidiazuron (TDZ) e cinetina (CIN), em diferentes concentrações e sob duas condições de luminosidade; BAP e CIN combinados ou não com ácido naftalenoacético (ANA); e BAP e CIN isoladamente ou combinados entre si. Segmentos de epicótilo de 1 cm de comprimento, provenientes de plântulas de laranja-azeda germinadas in vitro, foram utilizados como explantes. Para induzir a formação de gemas, os segmentos foram cultivados em meio MT com ou sem adição de fi torreguladores. O material foi cultivado a 27ºC em ausência de luz por 30 dias, seguidos de fotoperíodo de 16 horas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro ou cinco repetições, a depender do experimento e, cada repetição foi constituída de placa de Petri com 20 explantes. Após 60 ou 70 dias de cultivo foram avaliados o percentual de explantes responsivos e o número de gemas por explante. A adição de BAP ao meio de cultura, combinada ou não com ANA, e em combinações com CIN promovem melhor resposta organogênica.Termos para indexação: Citrus aurantium, fi torregulador, micropropagação, organogênese. In vitro induction and culture of adventitious buds in epicotyl segments of sour orangeAbstract -The objective of this work was to evaluate the induction and formation of adventitious buds in sour orange explants through the use of plant regulators. In vitro organogenesis experiments were conducted to evaluate the effect of BAP, TDZ, and KIN in different concentrations and under two light conditions; BAP and KIN, combined or not with NAA; BAP and KIN, separately or in combined concentrations. Sour orange epicotyl segments (1 cm length), from in vitro germinated plants, were used as explants. In order to induce bud formation, the explants were cultured in MT medium with or without the addition of plant regulators. The material was cultivated at 27ºC in the absence of light for 30 days, followed of culture under a 16-hour photoperiod. The experimental design was completely randomized, with four or fi ve replicates, depending on the experiment; each replicate comprised one Petri dish with 20 explants. After 60 or 70 days of cultivation, the percentage of responsive explants and the number of buds were evaluated. The addition of BAP to the culture medium, combined or not with ANA, and in combinations with CIN, induces better organogenic response.