Eugenol oxidase (EUGO), a member of the vanillyl alcohol oxidase family, catalyzes the oxidative reaction of vanillyl alcohol to vanillin. This compound is responsible for the vanilla aroma and is widely used as a flavoring agent in food, cosmetics, and pharmaceuticals. Previously, EUGO was cloned and expressed in E. coli TOP10, and purified by anion-exchange chromatography with Q-Sepharose resin but the purification factor was low. To improve the efficiency of the EUGO purification, in this study, we cloned eugo gene into pET-28a vector and expressed it in E. coli Tunetta. The SDS-PAGE analysis of protein extracts obtained from E. coli expressing EUGO under different induction conditions showed that EUGO was expressed mostly in the soluble fraction at 6 hours after induction with 0.1 mM IPTG at 25oC. EUGO was purified by immobilized−metal affinity chromatography with Ni2+-NTA agarose and the in vitro enzymatic activity was characterized. The specific activity of purified EUGO was nearly 4-fold higher than that of the crude enzyme sample. In particular, the enzyme preparation produced by the purification method based on Ni-NTA affinity in this study was 2,5-fold more pure than that produced by Q-sepharose purification method described previously.
Tóm tắt: Cis-prenyltranferase (CPT) là enzyme xúc tác phản ứng trùng ngưng liên tiếp các đơn vị isopentenyl diphosphate (IPP) lên các chất nhận allylic diphosphate để tổng hợp các cisprenyldiphosphate với chiều dài chuỗi khác nhau, từ neryl diphosphate đến cao su thiên nhiên. Ngoài hai trình tự HRT1 (Hevea rubber transferase 1) và HRT2 (Hevea rubber transferase 1) mã hóa cho các cis-prenyltranferase tham gia trong quá trình tổng hợp cao su thiên nhiên đã được phân lập và nghiên cứu, các gene mã hóa các CPT còn lại trong họ enzyme cis-prenyltranferase vẫn chưa được khảo sát chức năng. Kết quả tra cứu ban đầu trên cơ sở dữ liệu hệ phiên mã của cây cao su Hevea brasiliensis bằng phần mềm TBLASTX với trình tự truy vấn HRT2 cho ra 6 "hit" trình tự. Trong số này có một "hit" chứa trình tự mã hóa protein tương đồng 75% với HRT2 và được đặt tên là HbCPT4. Gene HbCPT4 được dự đoán có 3 exon và 2 intron. Trình tự mã hóa (CDS) HbCPT4 được phân lập thành công từ mẫu cDNA của mủ cao su Hevea brasiliensis RRIV 209, được giải trình tự và so sánh với trình tự dự đoán in silico. Trình tự CDS HbCPT4 phân lập từ thực nghiệm và trình tự CDS HbCPT4 được dự đoán in silico khác nhau 7 nucleotide, tuy nhiên hai trình tự polypeptide được suy ra từ hai trình tự CDS này thì hoàn toàn giống nhau. Protein HbCPT4 được dự đoán có 296 amino acid, có trọng lượng phân tử khoảng 34 kDa, pI khoảng 8,19 và chứa 5 vùng bảo tồn (vùng I-V) liên quan đến hoạt tính xúc tác và khả năng liên kết cơ chất của các enzyme họ cis-prenyltransferase (CPT).
scite is a Brooklyn-based organization that helps researchers better discover and understand research articles through Smart Citations–citations that display the context of the citation and describe whether the article provides supporting or contrasting evidence. scite is used by students and researchers from around the world and is funded in part by the National Science Foundation and the National Institute on Drug Abuse of the National Institutes of Health.
hi@scite.ai
10624 S. Eastern Ave., Ste. A-614
Henderson, NV 89052, USA
Copyright © 2024 scite LLC. All rights reserved.
Made with 💙 for researchers
Part of the Research Solutions Family.