To better comprehend the structural and biochemical underpinnings of ion uptake across the gills of true freshwater crabs, we performed an ultrastructural, ultracytochemical and morphometric investigation, and kinetically characterized the Na(+),K(+)-ATPase, in posterior gill lamellae of Dilocarcinus pagei. Ultrastructurally, the lamellar epithelia are markedly asymmetrical: the thick, mushroom-shaped, proximal ionocytes contain elongate mitochondria (41% cell volume) associated with numerous (≈14 µm² membrane per µm³cytoplasm), deep invaginations that house the Na(+),K(+)-ATPase, revealed ultracytochemically. Their apical surface is amplified (7.5 µm² µm⁻²)) by stubby evaginations whose bases adjoin mitochondria below the subcuticular space. The apical membrane of the thin, distal ionocytes shows few evaginations (1.6 µm² µm⁻²), each surrounding a mitochondrion, abundant in the cytoplasm below the subcuticular space; basolateral invaginations and mitochondria are few. Fine basal cytoplasmic bridges project across the hemolymph space, penetrating into the thick ionocytes, suggesting ion movement between the epithelia. Microsomal Na(+),K(+)-ATPase specific activity resembles marine crabs but is ≈5-fold less than in species from fluctuating salinities, and freshwater shrimps, suggesting ion loss compensation by strategies other than Na(+) uptake. Enzyme apparent K(+) affinity attains 14-fold that of marine crabs, emphasizing the relevance of elevated K(+) affinity to the conquest of fresh water. Western blotting and biphasic ouabain inhibition disclose two α-subunit isoforms comprising distinct functional isoenzymes. While enzyme activity is not synergistically stimulated by NH(4) (+) and K(+), each increases affinity for the other, possibly assuring appropriate intracellular K(+) concentrations. These findings reveal specific structural and biochemical adaptations that may have allowed the establishment of the Brachyura in fresh water.
To better understand the biochemical mechanisms underlying anisosmotic extracellular regulation in the freshwater Brachyura, we kinetically characterized the V-ATPase from the posterior gills of Dilocarcinus pagei, acclimated for 10days to salinities up to 21‰. Specific activity was highest in fresh water (26.5±2.1U mg(-1)), decreasing in 5‰ to 21‰, attaining 3-fold less at 15‰. Apparent affinities for ATP and Mg(2+) respectively increased 3.2- and 2-fold at 10‰, suggesting expression of different isoenzymes. In a 240-h time-course study of exposure to 21‰, maximum specific activity decreased 2.5- to 4-fold within 1 to 24h while apparent affinities for ATP and Mg(2+) respectively increased by 12-fold within 24h and 2.4-fold after 1h, unchanged thereafter. K(I) for bafilomycin A(1) decreased 150-fold after 1h, remaining constant up to 120h. This is the first kinetic analysis of V-ATPase specific activity in crustacean gills during salinity acclimation. Our findings indicate active gill Cl(-) uptake by D. pagei in fresh water, and short- and long-term down-regulation of V-ATPase-driven ion uptake processes during salinity exposure, aiding in comprehension of the biochemical adaptations underpinning the establishment of the Brachyura in fresh water.
AGRADECIMENTOS À Profa. Dra. Rosa dos Prazeres Melo Furriel Inocentes, pessoa muito especial e por quem tenho um grande afeto, obrigada pela paciente orientação e dedicação, que contribuiu muito para o meu conhecimento e crescimento profissional. Ao Prof. Dr. Francisco de Assis Leone, agradeço a sua colaboração profissional para a realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. John Campebell McNamara, e seu aluno Rogério, pela realização das coletas e colaboração científica na realização deste trabalho. Ao Douglas Chodi Masui, pela inestimável ajuda, paciência e amizade.Aos colegas do laboratório Nara, Sandra, Flávio, César, Thaís, Malson, Daniela, Raquel, João Carlos, Talita, Daiane, Luana, Rômulo e aos colegas dos laboratórios de vizinhos, pela amigável convivência.À Ivana e ao Nilton, pelo suporte técnico e atenção.Às minhas grandes amigas especiais Patrícia, Marcilene, Francielle, Francielen, Simoni, Juliana e Paula, que sempre estiveram presente, tanto nos melhores momentos, quanto nos mais difíceis.Ao Anderson, obrigada pelo incentivo, pela amizade e companheirismo. À minha amável família que me deu apoio nesta fase da minha vida.Capes pelo apoio financeiro concedido para a realização deste trabalho. ABREVIATURAS Abreviatura Nome ADPAdenosina-5'-difosfato ATP Adenosina-5'-trifosfato ATPase Adenosina-5'-trifosfatase BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato Da Dalton DMSO Dimetilsulfóxido DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilenodiamino tetracético FEP Fosfoenolpiruvato FGQ Fosfoglicerato quinase GAF 3-fosfogliceraldeído dietil acetal GAFDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase Hepes ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-etanol sulfônico K 0,5 Constante de dissociação aparente do complexo enzima -metal K I Constante de dissociação aparente do complexo enzima-inibidor K M Constante de Michaelis-Mentem A atividade V-ATPase branquial de D. pagei diminuiu acentuadamente em resposta à exposição à salinidade de 21‰. Após 1h de exposição, a atividade diminuiu cerca de 3 vezes, chegando a 4 vezes após 24h, o que indica a atuação de mecanismos eficientes de regulação a curto prazo. Curiosamente, a atividade V-ATPase foi cerca de 2 vezes maior para um tempo de aclimatação de 120h a 21‰, comparado a 24 h, embora 2 vezes menor que a estimada em água doce. Passadas 240 h, a atividade voltou aos baixos níveis observados entre 1h e 24h, o que indica a ação de mecanismos de regulação a longo prazo. Além da diminuição da atividade específica também foi observado aumento da afinidade da enzima por ATP (12 vezes) e Mg 2+ (3 vezes) em resposta à exposição dos animais a 21‰. Similarmente, ocorreu um aumento de até 190 vezes na afinidade da enzima por bafilomicina A 1 . Propõe-se que, em resposta à alteração de salinidade, ocorrem mudanças conformacionais tanto em V 1 (onde se encontram os sítios de ligação de ATP e Mg 2+ ) quanto V 0 (onde se localiza o sítio de ligação de bafilomicina), resultando numa maior exposição do sítio para o inibidor e no aumento da afinidade por Mg 2+ e ATP. Como os aumentos de afinidade são observados já após 1h de expo...
scite is a Brooklyn-based organization that helps researchers better discover and understand research articles through Smart Citations–citations that display the context of the citation and describe whether the article provides supporting or contrasting evidence. scite is used by students and researchers from around the world and is funded in part by the National Science Foundation and the National Institute on Drug Abuse of the National Institutes of Health.
customersupport@researchsolutions.com
10624 S. Eastern Ave., Ste. A-614
Henderson, NV 89052, USA
This site is protected by reCAPTCHA and the Google Privacy Policy and Terms of Service apply.
Copyright © 2024 scite LLC. All rights reserved.
Made with 💙 for researchers
Part of the Research Solutions Family.