A sálvia (Salvia officinalis) contém altos teores de ácido rosmarínico (RA), uma substância bioativa, bem como outros polifenóis. RA é facilmente oxidável e pode sofrer degradação durante a preparação da amostra para análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método analítico para a determinação do RA em sálvia, usando planejamento fatorial para a otimização da preparação de amostras. Inicialmente foram determinadas as variáveis estatisticamente significativas para melhorar o rendimento da extração do RA, as quais foram depois otimizadas usando planejamento composto central (CCD). O método analítico foi validado e aplicado na análise de amostras comerciais de sálvia. O procedimento otimizado consistiu na extração com metanol aquoso (40%) contendo uma mistura antioxidante (ácido ascórbico e ácido etileno diamino tetracético (EDTA)), com sonicação a 45 o C por 20 min. As amostras foram injetadas em um sistema contendo coluna C 18 , usando metanol (A) e ácido fosfórico aquoso 0.1% (B) em gradiente (45A:55B, 0-5 min; 80A:20B, 5-10 min) com fluxo de 1.0 mL min −1 e deteção em 330 nm. Utilizando estas condições, as concentrações do RA foram 50% maiores quando comparadas com extração na ausência de antioxidante (recuperação de 98,94 ± 1,07%). Auto-oxidação do RA durante a preparação da amostra foi evitada pelo uso de antioxidante levando a resultados analíticos mais confiáveis. O método foi então aplicado na análise de amostras comerciais de sálvia.Sage (Salvia officinalis) contains high amounts of the biologically active rosmarinic acid (RA) and other polyphenolic compounds. RA is easily oxidized, and may undergo degradation during sample preparation for analysis. The objective of this work was to develop and validate an analytical procedure for determination of RA in sage, using factorial design of experiments for optimizing sample preparation. The statistically significant variables for improving RA extraction yield were determined initially and then used in the optimization step, using central composite design (CCD). The analytical method was then fully validated, and used for the analysis of commercial samples of sage. The optimized procedure involved extraction with aqueous methanol (40%) containing an antioxidant mixture (ascorbic acid and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)), with sonication at 45 o C for 20 min. The samples were then injected in a system containing a C 18 column, using methanol (A) and 0.1% phosphoric acid in water (B) in step gradient mode (45A:55B, 0-5 min; 80A:20B, 5-10 min) with flow rate of 1.0 mL min −1 and detection at 330 nm. Using this conditions, RA concentrations were 50% higher when compared to extractions without antioxidants (98.94 ± 1.07% recovery). Auto-oxidation of RA during sample extraction was prevented by the use of antioxidants resulting in more reliable analytical results. The method was then used for the analysis of commercial samples of sage.
Glycosylation often plays a key role in the safety and efficacy of therapeutic proteins to patients, thus underlying the need for consistent control of this important post-translational modification during biologics production. In this study, we profiled the site-specific evolution of N-glycans on a CTLA4-Fc-fusion protein, from the intracellular secretory pathway to the conditioned medium (CM) in fed-batch cell culture. For this, we developed an approach that combined sub-cellular fractionation with liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analyses. The study revealed that there was a significant amount of heterogeneity in the glycans displayed amongst the three distinct N-glycosylation sites. Furthermore, 54-60% of the intracellular protein was characterized by Man8 and Man9 glycans on day 10, when the cell density peaks, indicative of a significant bottleneck between the endoplasmic reticulum (ER) and the cis-Golgi. At longer culture duration, the accumulation of intracellular protein with bi-antennary-fucosylated GlcNAc-terminated residues identified the formation of another bottleneck in the medial and trans-Golgi compartments, which subsequently led to a decrease in sialylated species in the secreted protein. Glucose deprivation caused a reduction in the Man8 and Man9 glycans in favor of Man5 glycans and bi-antennary-fucosylated GlcNAc-terminated residues in the organellar pool of the Fc-fusion protein. However, transient deprivation of glucose did not lead to major differences in the glycan profile of proteins secreted into the CM. The approach developed here allows us to probe the secretory pathway and sheds light on the site-specific intracellular processing of glycans during fed-batch cell culture, thus serving as an initial step towards their rational control. Biotechnol. Bioeng. 2017;114: 1550-1560. © 2017 Wiley Periodicals, Inc.
Resumo: O fruto da mangabeira apresenta diversas propriedades nutricionais e sobre este é crescente o interesse mercadológico, no entanto, asua reduzida vida útil póscolheita, tem inviabilizado o comércio a longas distâncias e o armazenamento. Este trabalho objetivou quantificar a atividade de peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO)na polpa de frutos de mangaba, embalados em PVC e acondicionados a 10 e 25ºC, aos 3, 6 e 9 dias de armazenamento, e determinar a capacidade de películas de fécula de mandioca em inibir a atividade dessas enzimas. A atividade da POD foi sempre superior à de PPO, nas duas temperaturas e em todos os tempos de armazenamento testados. A temperatura de 25°C foi a que melhor inibiu a atividade das duas enzimas. Os dados não mostraram diferença estatística com relação à atividade de POD na polpa, em função da concentração de fécula utilizada na película de recobrimento dos frutos. Já para PPO a menor atividade foi encontrada na polpa dos frutos recobertos com a maior concentração de fécula testada (4%).
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