Purpose: Amniotic membrane stem cells have a high capacity of proliferation, cell expansion, and plasticity, as well as immunomodulatory properties that contribute to maternal-fetal tolerance. Owing to the lack of research on human amniotic membrane at different gestational stages, the canine model is considered ideal because of its genetic and physiological similarities. We aimed to characterize the canine amniotic membrane (CAM) cell lineage in different gestational stages and evaluate the expression of immunomodulatory genes. Materials and Methods: Twenty CAMs from early (20-30 days) (n=7), mid-(31-45 days) (n=7), and late gestation (46-63 days) (n=6) stages were studied. The cell features were assessed by cell viability tests, growth curve, colony-forming units, in vitro differentiation, cell labeling for different immunophenotypes, and pluripotent potential markers. The cells were subjected to RT-PCR and qPCR analysis to determine the expression of IDO, HGF, EGF, PGE2, and IL-10 genes. Results: CAM cells exhibited a fibroblastoid morphology and adherence to plastic with an average cell viability of 78.5%. The growth curve indicated a growth peak in the second passage and we obtained an average of 138.2 colonies. Osteogenic, chondrogenic, and adipogenic lineages were confirmed by in vitro differentiation assays. Cellular immunophenotyping experiments confirmed the presence of positive mesenchymal markers (CD90 and CD105) and the low or negative expression of hematopoietic markers (CD45 and CD34). Qualitative analysis of the immunomodulatory functions indicated the expression of the IDO, HGF, EGF5, and PGE2 genes. When stimulated by interferon-gamma, CAM cells exhibited higher IDO levels throughout gestation. Conclusion: The CAMs from different gestational stages presented features consistent with mesenchymal stem cell lineage; better results were observed during the late gestation stage. Therefore, the gestational stage is a key factor that may influence the functionality of therapies when using fetal membrane tissues from different periods of pregnancy.

In regenerative medicine stem cell biology has become one of the most interesting and more often studied subject. The amniotic membrane is the innermost layer of the fetal membranes and is considered a potential tool to treat many pathologies. It is used because it can be collected from discarded fetal material and is a rich source of stem cells with high proliferation and plasticity ratio capable of proliferating and differentiate in vitro. We propose to elucidate the characteristics and potencial clinical application of cells derived of amniotic membrane in veterinary medicine.

No abstract

A membrana amniótica é uma das membranas fetais presentes no período gestacional e que é considerada uma ferramenta potencial no tratamento de diversas patologias, como na cicatrização de feridas de pele e córnea, hérnias, cirurgias reconstrutivas e prevenção de aderências. As células-tronco (CT) obtidas de membrana amniótica apresentam alta taxa de proliferação e plasticidade, além de propriedades imunomoduladoras que participam no processo de tolerância maternofetal. Devido à dificuldade e a escassez de estudos envolvendo a membrana amniótica humana em diferentes estágios gestacionais, optamos pela escolha do modelo canino, pois pode ser considerado um modelo ideal devido às semelhanças genéticas e fisiológicas com humanos. Baseado no potencial das CT de membrana amniótica, os objetivos deste trabalho foram caracterizar as CT de membrana amniótica canina (MAC) em diferentes estágios gestacionais e avaliar a expressão de genes relacionados à imunomodulação. Para tanto, foram utilizados 20 fetos caninos, sem raça definida com três idades gestacionais, terço inicial (20-30 dias) (n=7), terço médio (31-45 dias) (n=7) e terço-final (46-63 dias) (n=6), oriundos de programas de castrações. As células das MAC foram caracterizadas por meio de testes de viabilidade celular, curva de crescimento, unidade formadora de colônia (UFC-F), diferenciação in vitro, imunofenotipagem celular e potencial pluripotente. Para avaliação dos aspectos imunomoduladores, as células foram submetidas a RT-qPCR, com intuito de determinar a expressão gênica de IDO, HGF, EGF, PGE2, IL-6 e IL10. Como resultados, as células de MAC apresentaram morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico com viabilidade celular de 83,3% em terço inicial, 80,1% em terço médio e 75,22% em terço final. Na análise da curva de crescimento, as células apresentaram pico de crescimento em segunda passagem, com posterior queda e uma tendência estacionária. Na UFC-F, obtivemos uma média de 145 colônias em terço inicial, 142,3 colônias em terço médio e 127,3 colônias em terço final. Na diferenciação in vitro, as células se diferenciaram em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas após 21 dias de cultivo celular. Na imunofenotipagem celular, as células de terço inicial obtiveram marcação de CD90 (31,7%), CD105 (5,6%), CD34 (0,3%) e CD45 (0,4%), terço médio de CD90 (36,7%), CD105 (6,3%), CD34 (0,2%0 e CD45 (0,4%), terço final CD90 (67,1%), CD105 (96,4%), CD34 (4,4%) e CD45 (2,0). Na avaliação imunomoduladora, observamos a expressão qualitativa dos genes IDO, HGF, EGF, PGE2 e a não expressão dos genes IL-6 e IL-10. Na expressão quantitativa, houve somente a expressão do gene IDO, com maior expressão em terço médio e final. Neste contexto, concluímos que as células de MAC de diferentes estágios gestacionais apresentam características compatíveis com CT mesenquimais e que a idade gestacional de terço final apresentou melhores resultados. Palavras-chave: Âmnio. Cão. Células-tronco. Citocinas. Imunomodulação.