Small Vectors for Expression Based on Dominant Drug Resistance with Direct Multicopy Selection

Higgins, David R.; Busser, Katie; Comiskey, John; Whittier, Peter S.; Purcell, Thomas J.; Hoeffler, James P.

doi:10.1385/0-89603-421-6:41

Cited by 69 publications

(55 citation statements)

References 17 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…Over the years, numerous auxotrophic and dominant selectable markers have been developed [8][9][10][11] and used to construct protein expression vectors for various applications. Commonly, a gene of interest is integrated into the P. pastoris genome using a plasmid that is either linearized in the auxotrophic marker gene, another homologous genomic region in the plasmid, or in the AOX1 promoter fragment, and then transformed into the appropriate auxotrophic mutant.…”

mentioning

confidence: 99%

A color-based stable multi-copy integrant selection system forPichia pastorisusing the attenuatedADE1andADE2genes as auxotrophic markers

Battles

Nett

2012

Bioengineered

View full text Add to dashboard Cite

mentioning

confidence: 99%

A color-based stable multi-copy integrant selection system forPichia pastorisusing the attenuatedADE1andADE2genes as auxotrophic markers

Battles

Nett

2012

Bioengineered

View full text Add to dashboard Cite

Section: санкт-петербургский государственный университетunclassified

“…Кроме того, существует возможность конс-труирования кассеты экспрессии на основе вектора, несущего в качестве селективного маркера один из генов устойчивости к действию антибиотиков. К числу этих маркерных генов относятся гены устойчивости к зеоцину (ZeoR) (Higgins et al, 1998), бластицидину (BlaR), генетицину (G418R) (Scorer et al, 1994;Sunga & Cregg, 2004).Другим подходом является конструирование нескольких векторов экс-прессии с различными селективными маркерами и последующая их ин-теграция в геном штаммов P. pastoris. При этом чаще всего применяют-ся плазмидные векторы, которые содержат ген гистидинолдегидрогеназы HIS4 в качестве селективного маркера, и соответствующие им ауксотроф-ные штаммы.…”

unclassified

Creation of new pichia pastoris strains for recombinant protein production

Muzaev

Михайлович²,

Rumyantsev

et al. 2015

Ecological genetics

View full text Add to dashboard Cite

д. м. музаев, а. м. румянцев, © е. В. самбук, м. В. Падкина Санкт-Петербургский государственный университетдрожжи Pichia pastoris исполь-зуются для синтеза множества рекомбинантных белков. широ-кое применение этого вида дрожжей в биотехнологии обусловлено отно-сительной простотой культивирова-ния, дешевизной используемых сред и возможностью осуществления посттрансляционных модификаций белков. основными способами по-вышения выхода рекомбинантного белка являются увеличение числа копий генов, кодирующих иссле-дуемый белок, а также коэкспрес-сия вспомогательных факторов, участвующих в фолдинге, созре-вании и секреции белка. необхо-димым условием для применения этих подходов является расширение коллекции ауксотрофных мутантов. В ходе данной работы была создана коллекция плазмид и штаммов, поз-воляющая осуществлять множес-твенную интеграцию чужеродных генов в геном P. pastoris.ключевые слова: C Pichia pastoris; рекомбинантные белки; экспрессия генов; генная инженерия. новые штаммы дрожжей Pichia Pastoris -продуценты гетерологичных белков ВВЕДЕНИЕ Дрожжи P. pastoris широко используются для наработки самых разно-образных белков, начиная от столбнячного токсина и эпидермального фак-тора роста мыши и заканчивая мембранными белками, включающими ABC транспортеры, аквапорины и тетраспанины (Darby et al., 2012;Cregg et al., 2000). Исходя из опыта применения P. pastoris в биотехнологии известно, что существует приблизительно 50-75%-я вероятность удачного синтеза любого чужеродного белка в P. pastoris. При этом использование дрожжей P. pastoris открывает широкие возможности для оптимизации условий куль-тивирования, что позволяет достигать необычайно высоких уровней продук-ции целевого белка .Активное использование дрожжей P. pastoris в современных биотехноло-гических производствах напрямую связано с особенностями их метаболизма. К преимуществам метилотрофных дрожжей можно отнести простоту культи-вирования, относительную дешевизну среды и возможность применения раз-личных методик генетических манипуляций. Ещё одной особенностью этого вида дрожжей является способность осуществлять посттрансляционные мо-дификации, характерные для белков высших эукариот.В биотехнологии при работе с дрожжами самой сложной задачей яв-ляется достижение оптимального баланса между уровнем синтеза целе-вого белка и жизнеспособностью штаммов-продуцентов. Применение P. pastoris открывает широчайшие возможности для оптимизации условий культивирования. Одним из способов увеличения уровня синтеза целевого белка является получение штаммов P. pastoris, несущих множественные копии чужеродного гена. Другим подходом, чаще всего используемым при работе с секреторными белками, является коэкспрессия генов, кодирую-щих различные вспомогательные факторы. Для успешного применения этих подходов необходимо создание коллекции плазмид, позволяющих осуществлять множественную интеграцию чужеродных генов в геном P. pastoris, а также получение множественно-маркированных штам-мов-продуцентов.Одной из стратегий усиления экспрессии специфичного гена в P. pastoris является увеличен...

show abstract

“…These findings parallel other reports whereby integration of greater than 20 copies of the expression cassette containing the gene sequence for tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) resulted in a 200-fold increase in expression. 53 A further advantage of the vectors used in the present investigation is that the Sh ble gene product can be used as a selectable marker in bacteria, 54 which means the resulting plasmids are considerably smaller and hence easier to manipulate than other P. pastoris expression vectors. Despite its slightly lower viability and efficiency of transformation, the SMD1168 P. pastoris strain, deficient in the vacuolar proteases pep4, carboxypeptidase Y, and proteinase B, 36 was utilized in the present investigations in an attempt to decrease the potential for proteolysis of the secreted activin protein.…”

Section: Initial Expression Trialsmentioning

confidence: 99%

Optimization of the expression of recombinant human activin A in the yeast Pichia pastoris

Fredericks

Clay

Warner

et al. 2010

Biotechnology Progress

View full text Add to dashboard Cite

We report a new procedure to express recombinant human activin A using the methanolic yeast, Pichia pastoris. Optimization of culture procedures has involved comprehensive examination of the effects of culture vessel shape, volume of broth in the induction and expression cultures, methanol concentration, culturing temperature, and pH of the expression cultures. After this optimization, as well as modification of the native cleavage sites, a laboratory scale procedure has been established which routinely produced 2-10 mg/L amounts of this vital growth factor in the highly efficient, eukaryotic yeast system. This system avoids the need to produce this protein and similar TGF-beta proteins in mammalian cell lines which, in addition to being costly, produce many native binding partners of these cystine knot proteins, a factor which can dramatically affect yields of the target protein.

show abstract

Small Vectors for Expression Based on Dominant Drug Resistance with Direct Multicopy Selection

Cited by 69 publications

References 17 publications

A color-based stable multi-copy integrant selection system forPichia pastorisusing the attenuatedADE1andADE2genes as auxotrophic markers

A color-based stable multi-copy integrant selection system forPichia pastorisusing the attenuatedADE1andADE2genes as auxotrophic markers

Creation of new pichia pastoris strains for recombinant protein production

Optimization of the expression of recombinant human activin A in the yeast Pichia pastoris

Contact Info

Product

Resources

About