Creation of new pichia pastoris strains for recombinant protein production

Abstract

д. м. музаев, а. м. румянцев, © е. В. самбук, м. В. Падкина Санкт-Петербургский государственный университетдрожжи Pichia pastoris исполь-зуются для синтеза множества рекомбинантных белков. широ-кое применение этого вида дрожжей в биотехнологии обусловлено отно-сительной простотой культивирова-ния, дешевизной используемых сред и возможностью осуществления посттрансляционных модификаций белков. основными способами по-вышения выхода рекомбинантного белка являются увеличение числа копий генов, кодирующих иссле-дуемый белок, а также коэкспрес-сия вспомогательных факторов, участвующих в фолдинге, созре-вании и секреции белка. необхо-димым условием для применения этих подходов является расширение коллекции ауксотрофных мутантов. В ходе данной работы была создана коллекция плазмид и штаммов, поз-воляющая осуществлять множес-твенную интеграцию чужеродных генов в геном P. pastoris.ключевые слова: C Pichia pastoris; рекомбинантные белки; экспрессия генов; генная инженерия. новые штаммы дрожжей Pichia Pastoris -продуценты гетерологичных белков ВВЕДЕНИЕ Дрожжи P. pastoris широко используются для наработки самых разно-образных белков, начиная от столбнячного токсина и эпидермального фак-тора роста мыши и заканчивая мембранными белками, включающими ABC транспортеры, аквапорины и тетраспанины (Darby et al., 2012;Cregg et al., 2000). Исходя из опыта применения P. pastoris в биотехнологии известно, что существует приблизительно 50-75%-я вероятность удачного синтеза любого чужеродного белка в P. pastoris. При этом использование дрожжей P. pastoris открывает широкие возможности для оптимизации условий куль-тивирования, что позволяет достигать необычайно высоких уровней продук-ции целевого белка .Активное использование дрожжей P. pastoris в современных биотехноло-гических производствах напрямую связано с особенностями их метаболизма. К преимуществам метилотрофных дрожжей можно отнести простоту культи-вирования, относительную дешевизну среды и возможность применения раз-личных методик генетических манипуляций. Ещё одной особенностью этого вида дрожжей является способность осуществлять посттрансляционные мо-дификации, характерные для белков высших эукариот.В биотехнологии при работе с дрожжами самой сложной задачей яв-ляется достижение оптимального баланса между уровнем синтеза целе-вого белка и жизнеспособностью штаммов-продуцентов. Применение P. pastoris открывает широчайшие возможности для оптимизации условий культивирования. Одним из способов увеличения уровня синтеза целевого белка является получение штаммов P. pastoris, несущих множественные копии чужеродного гена. Другим подходом, чаще всего используемым при работе с секреторными белками, является коэкспрессия генов, кодирую-щих различные вспомогательные факторы. Для успешного применения этих подходов необходимо создание коллекции плазмид, позволяющих осуществлять множественную интеграцию чужеродных генов в геном P. pastoris, а также получение множественно-маркированных штам-мов-продуцентов.Одной из стратегий усиления экспрессии специфичного гена в P. pastoris является увеличен...