Introducción: El tamizaje neonatal es un examen de laboratorio utilizado a escala mundial para la detección de patologías o déficits metabólicos antes de que la enfermedad se manifieste, pero del cual existe poco conocimiento en las gestantes.Objetivo: Determinar el nivel de conocimiento que tienen las mujeres embarazadas sobre la prueba de Tamizaje Metabólico Neonatal. Métodos: Se trató de una investigación cuantitativa, descriptiva y transversal, desarrollada en una institución de salud pública en la provincia de Cotopaxi con una muestra de 200 mujeres. La recolección de datos se realizó a través de una encuesta que permitió clasificar el conocimiento en: alto, medio, y bajo.Resultados: el mayor porcentaje de gestantes se ubicó en nivel medio de conocimiento (44 %), se presentó un porcentaje considerable de gestantes en nivel bajo (43,5 %) y en menor proporción un nivel alto (12,5 %). La mayor relación de conocimientos bajo se observó en las gestantes más jóvenes (15 a 20 años) y las de mayor edad (más de 43 años), así como en aquellas de instrucción primaria y secundaria. Conclusión: El nivel de conocimiento que poseen las gestantes sobre el tamizaje metabólico neonatal sobre la dimensión conocimiento general de la prueba y el procedimiento médico, fue medio en aquellas de edades comprendidas entre los 21 y 42 años y bajo en aquellas de 15 a 20 años, así como en las de 43 años a más. Lo que demuestra que existe falta conocimiento sobre la prueba en las gestantes asistentes esta unidad de salud.