Potential role of two cytochrome P450s obtained from Lithospermum erythrorhizon in catalyzing the oxidation of geranylhydroquinone during Shikonin biosynthesis

Shikonins as natural products from traditional Chinese medicinal plants: their biosynthesis, genetic regulation, structuralmodifications, and pharmaceutical functions

“…)菌丝体的粗提物能够促进紫草素的生 成。随后，宁文等 [34~36] 发现曲霉属真菌(Aspergillus sp. )，尤其是米曲霉 (Aspergillus Oryzae)菌丝体的粗提物和真菌诱导物的添加能够使滇紫草愈伤细 胞的紫草素总量和乙酰紫草宁的相对含量和产量提高一倍， 但其也会使细胞碳源 消耗增多、胞内可溶蛋白合成量上升、细胞生长受到抑制，因此其促进作用与添 加浓度紧密相关。刘长军等 [37] 也发现黑曲霉诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞中 紫草素的合成和外排具有高效促进作用。除曲霉属真菌外，Brigham等 [38] [45] 。 由于 Gaisser 等 [46] ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=373122)，紫草 中香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase, GGPPS)、 法尼 基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS)等酶相关基因也已鉴定 [48] ， 而该途径中最为关键且唯一的限速酶 HMGR 仅检测到一个 433bp 序列，但至今 尚无对其进行直接功能验证的报道 [49] 。 PHB 是紫草素生物合成的另一重要前体，研究认为，其在紫草植物中主要来 源于 PP 途径 [43] 。该途径中已知的肉桂酸-4-羟化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase, C4H) 、4-香豆酸辅酶 A 连接酶(4-coumarate:CoA ligase, 4CL)和苯丙氨酸解氨 酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)等相关基因序列在紫草和软紫草中均已 被鉴定和克隆 [50,51] 。其中，PAL 酶基因作为 PP 途径的起始酶基因被认为可能参 与影响紫草素的合成。 在 GPP 和 PHB 均存在的情况下， 其可在关键酶 PGT 的催化作用下合二为一 生成 GHB，开启下游紫草素类化合物的合成。PGT 作为紫草素合成核心部分的 关键起始酶，在紫草与软紫草中均已被鉴定出是较大的基因家族，具有 14 个成 员不等，可见其极其重要的限速作用 [40] 。 从 GHB 生成紫草宁及其衍生物中的一系列酶促反应的研究，近些年也取得 了较大的进展，在紫草科植物中鉴定到了不同程度的相关酶基因。Wang 等 [44] [52,53] 。除此之外，Song 等 [54] [57] 最先从紫草中克隆出根部高表达的两个转录因子 LeEIL-1 和 LeERF-1，并对其基因的启动子区域进行了分析。之后，LeEIL-1 和 LeERF-1 的功能得到了进一步研究， 发现它们可能参与光信号和乙烯对紫草素的合成调控， 能够显著诱导紫草转基因毛状根中紫草宁及其衍生物的积累 [58,59] 。 Xie 等 [60] 人利 用转录组从新疆紫草中预测到 27 个 ERF 转录因子。Zhao 等 [61,62] 人从紫草中克 隆到 1 个 MYB 转录因子，认为它们的功能可能也与紫草素合成有关。 降解组测序、RLM-Race 等技术的发展为紫草科植物中 miRNA 的鉴定和功 能验证提供了很好的机会。Zhao 等 [63] 科物种的共同祖先， 可能是由于异戊烯转移酶祖先基因的逆转录转座复制事件导 致的。Tang等 [66] 也通过对车前叶蓝蓟进行基因组测序和分析，同时结合七个紫草 目其他物种的转录组数据， 探讨了紫草目在唇形分支中的分类地位及其全基因组 复制事件的发生，认为紫草目与茄目和唇形目更为近缘，且伽玛(γ)事件发生 后，紫草科物种可能至少经历了两轮WGD(whole genome duplications) ，并推测了 可能参与紫草宁生物合成核心通路的香叶基环化酶、 萘酚羟化酶和酰基转移酶等 关键酶基因。 除基因组外，转录组学、蛋白组学和代谢组学也被单独或整合用于完善紫草 等药用植物中次生代谢产物合成及调控通路研究。例如，Wu 等 [43] 通过对新疆紫 草、紫草和车前叶蓝蓟这三种紫草科植物的周皮、木质部、茎和叶等六个组织进 行转录组学分析，从中筛选出各物种在长期进化中被正向选择的基因，同时还发 现了两个蛋白 G10H 和 12OPR 可能与紫草素的生物合成相关。Yazaki 等 [67] 通过 对繁殖和产紫草素两阶段的紫草细胞进行蛋白质组学差异分析， 结合转录组数据， 从中鉴定出了乙酰紫草宁合成中必需的酰基化酶 LeSAT1。Xie 等 [60] [70] ；随后又合成获 得了一种呋喃甲酸紫草宁酯(SH-7, 1e)作为 DNA 拓扑异构酶抑制剂而发挥良 好的抗肿瘤活性 [71] 。基于此，2009 年 Wang 等…”

CYP82AR Subfamily Proteins Catalyze C-1′ Hydroxylations of Deoxyshikonin in the Biosynthesis of Shikonin and Alkannin

“…CYP76B subfamily enzymes from Arnebia euchroma or L . erythrorhizon catalyzed the 3″-hydroxylation step of GHQ. Intriguingly, CYP76B101 from L .…”

“…erythrorhizon catalyzed the three-step oxidation of GHQ at the C-3″ position to form a carboxylic acid derivative . The unique naphthoquinone skeleton formation was proposed to occur through intriguing cyclization of the oxidized geranyl chain (aldehyde or carboxylic acid) with the aromatic ring, but this has not been fully clarified. , Deoxyshikonin was isolated from the roots of L . erythrorhizon , and 14 C tracer experiments demonstrated that deoxyshikonin was the intermediate in the final step of shikonin biosynthesis .…”

“…Comparative transcriptomics has been successfully used to elucidate the biosynthesis pathways of natural products in Catharanthus roseus , and Salvia miltiorrhiza . , Previously, we conducted transcriptome sequencing for L . erythrorhizon roots and leaves+stems . Forty full-length CYP genes transcriptionally upregulated in the red roots have been cloned into the yeast expression vector pCf302-AtCPR1 with the required CYP reductase from Arabidopsis thaliana (AtCPR1) for further investigation .…”

“…erythrorhizon roots and leaves+stems . Forty full-length CYP genes transcriptionally upregulated in the red roots have been cloned into the yeast expression vector pCf302-AtCPR1 with the required CYP reductase from Arabidopsis thaliana (AtCPR1) for further investigation . The transcriptome data sets of different L .…”