Optimization of melting analysis with TaqMan probes for detection of KRAS, NRAS, and BRAF mutations

Ботезату, И. В.; Nechaeva, Irina O.; Строганова, А. М.; Сендерович, А. И.; Кондратова, В. Н.; Шелепов, В. П.; Lichtenstein, A. V.

doi:10.1016/j.ab.2015.09.005

Cited by 18 publications

(21 citation statements)

References 39 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…Selection of which of the two strands should be a target for the TaqMan probe can significantly affect discrimination between the wild-type and mutant alleles (Supplementary Figure S1). Thus, the ability to detect mutations in both strands of the amplicon can increase the reliability and sensitivity of the assay (14,15). …”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Taqman Probes as Blocking Agents for Enriched PCR Amplification and DNA Melting Analysis of Mutant Genes

et al. 2017

Self Cite

View full text Add to dashboard Cite

Asymmetric PCR and DNA melting analysis with TaqMan probes applied for mutation detection is effectively used in clinical diagnostics. The method is simple, cost-effective, and carried out in a closed-tube format, minimizing time, labor, and risk of sample cross-contamination. Although DNA melting analysis is more sensitive than Sanger sequencing (mutation detection thresholds are ~5% and 15%-20%, respectively), it is less sensitive than more labor-intensive and expensive techniques such as pyrosequencing and droplet digital PCR. Here, we demonstrate that, under specially selected conditions of asymmetric PCR, TaqMan probes can play the role of blocking agents. Preferential blocking of the wild-type allele brings about enriched amplification of mutant alleles. As a result, an ~10-fold increase in the detection sensitivity for mutant and genes was achieved.

show abstract

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Taqman Probes as Blocking Agents for Enriched PCR Amplification and DNA Melting Analysis of Mutant Genes

et al. 2017

Self Cite

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…Аналогично общепринятой практике двунитевого секвенирования ДНК исследование зондами TaqMan обеих нитей ампликона представляется целесообраз-ным, поскольку оно, по нашим данным, повышает надежность и чувствительность анализа [4].…”

Section: результаты и обсуждениеunclassified

“…Он прост в исполнении, производителен, экономичен и, кроме того, реализуется в «закрытом формате», исключающем перекрестное загрязнение образцов [3][4][5]. В наших предыдущих исследова-ниях было показано, что зонды TaqMan могут быть использованы не только для мониторинга полиме-разной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) и сканирования мутаций посредством DMA, но и в качестве блокирующих амплификацию Выявление мутаций в «горячих» участках генома: ампликоны-«шпильки» в методе плавления ДНК …”

unclassified

Detection of gene mutations in genome “hot” spots: “hairpin” amplicons in DNA melting analysis

et al. 2017

View full text Add to dashboard Cite

Введение Таргетная терапия онкологических заболеваний основана на предварительных исследованиях ключе-вых для определенной формы рака молекулярных по-казателей, в качестве которых наиболее часто высту-пают дефекты протоонкогенов и генов-супрессоров. Один из наиболее значимых объектов генодиагности-ки -онкоген KRAS, мутации которого в кодонах 12, 13 и 61 встречаются в ~ 40 % случаев рака толстой кишки [1] и прогнозируют негативный ответ на терапию ан-ти-EGFR (epidermal growth factor receptor, рецептор эпидермального фактора роста). Однако выявление генных мутаций зачастую осложняется рядом обстоя-тельств: 1) ограниченным количеством образца ДНК; 2) длительностью и стоимостью анализа, затратами труда и реактивов; 3) низким содержанием мутантных аллелей в исследуемом образце ДНК [2]. Критиче-ски важной в этой ситуации является возможность надежного, быстрого и экономичного сканирования генных мутаций.В наибольшей степени удовлетворяет этим тре-бованиям метод плавления ДНК (DNA melting analysis, DMA) с использованием гидролизуемых зондов TaqMan. Он прост в исполнении, производителен, экономичен и, кроме того, реализуется в «закрытом формате», исключающем перекрестное загрязнение образцов [3][4][5]. В наших предыдущих исследова-ниях было показано, что зонды TaqMan могут быть использованы не только для мониторинга полиме-разной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) и сканирования мутаций посредством DMA, но и в качестве блокирующих амплификацию Выявление мутаций в «горячих» участках генома: ампликоны-«шпильки» в методе плавления ДНК

show abstract

“…При разработке протокола учитывали влияние на температуру плавления гетеро-и гомодуплексов, сочетания флуорофора и гасителя, длины зондов, использования сенс-или антисенс-цепи ДНК в качест-ве мишени для зонда и некоторых других условий [23].…”

Section: результатыunclassified

“…Таким образом, наблюдалась лишь частичная ассоциация 2 биомаркеров. Обсуждение Обнаружение мутаций анализом кривых плавления ДНК с использованием зондов типа TaqMan является нетрудоемким, быстрым и относительно недорогим методом, снижающим возможность перекрестных кон-таминаций образцов [21,23]. Лежащая в основе мето-да ПЦР позволяет использовать фрагментированную ДНК, выделенную из рутинных парафиновых срезов опухолевых тканей, фиксированных формальдегидом.…”

Section: экспериментальные статьиunclassified

Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 genes mutations and MGMT methylation in gliomas

Tabakov¹,

Строганова²,

Сендерович³

et al. 2017

Usp. mol. onkol

View full text Add to dashboard Cite

Optimization of melting analysis with TaqMan probes for detection of KRAS, NRAS, and BRAF mutations

Cited by 18 publications

References 39 publications

Taqman Probes as Blocking Agents for Enriched PCR Amplification and DNA Melting Analysis of Mutant Genes

Taqman Probes as Blocking Agents for Enriched PCR Amplification and DNA Melting Analysis of Mutant Genes

Detection of gene mutations in genome “hot” spots: “hairpin” amplicons in DNA melting analysis

Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 genes mutations and MGMT methylation in gliomas

Contact Info

Product

Resources

About