Taqman Probes as Blocking Agents for Enriched PCR Amplification and DNA Melting Analysis of Mutant Genes

Abstract

Asymmetric PCR and DNA melting analysis with TaqMan probes applied for mutation detection is effectively used in clinical diagnostics. The method is simple, cost-effective, and carried out in a closed-tube format, minimizing time, labor, and risk of sample cross-contamination. Although DNA melting analysis is more sensitive than Sanger sequencing (mutation detection thresholds are ~5% and 15%-20%, respectively), it is less sensitive than more labor-intensive and expensive techniques such as pyrosequencing and droplet digital PCR. Here, we demonstrate that, under specially selected conditions of asymmetric PCR, TaqMan probes can play the role of blocking agents. Preferential blocking of the wild-type allele brings about enriched amplification of mutant alleles. As a result, an ~10-fold increase in the detection sensitivity for mutant and genes was achieved.

Target liquid biopsy using “enriched” polymerase chain reaction and DNA melting analysis

“…Ранее мы показали, что флуоресцентные зонды TaqMan в дополнение к уже известным их функциям (мониторингу в реальном времени ПЦР и плавления ДНК) также мо-гут служить блокирующими агентами, избирательно подавляющими амплификацию аллелей дикого типа. Основанный на этом наблюдении протокол «обогащенной» ПЦР-DMA обеспечивает значительное повышение чувствительности мутационного сканирования генов NRAS и BRAF [21]. Достигнутый уровень чувствительности этого подхода позволял надеяться на его применимость в качестве экспресс-метода жидкостной биопсии.…”

“…Асимметричная «обогащенная» ПЦР-DMA (субоптимальные условия) [21]. Образцы ДНК анализировали в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США), как описано ранее [21], с некоторыми модификациями.…”

“…Асимметричная «обогащенная» ПЦР-DMA (субоптимальные условия) [21]. Образцы ДНК анализировали в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США), как описано ранее [21], с некоторыми модификациями. Инкубационная смесь (25 мкл) содержала 50 мМ Трис-HCl (pH 8,8); 50 мМ KCl; 0,01 % Tween-20; 3 мМ MgCl 2 ; 0,25 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов; 0,2 × EvaGreen (Biotium, США); прямой и обратный праймеры в соотношении 1:15 или 15:1 (т. е.…”

“…В стандартных (оптимальных) условиях ПЦР незначительные различия в стабильности комплексов зонд/аллель не оказывают заметного влияния на ход реакции, однако в специально подобранных субоптимальных условиях (снижение концентрации фермента и температуры отжига, присутствие в инкубационной среде обоих зондов, укороченные циклы амплификации) эти различия становятся существенными, что позволяет дискриминировать интактные и мутантные аллели. Разработанный на этой основе прием «обогащения» значительно повышает чувствительность мутационного сканирования генов BRAF и NRAS, как показано нами ранее [21]. В данном исследовании «обогащенную» ПЦР-DMA применили для мутационного сканирования KRAS.…”

Detection of gene mutations in genome “hot” spots: “hairpin” amplicons in DNA melting analysis

“…В наших предыдущих исследова-ниях было показано, что зонды TaqMan могут быть использованы не только для мониторинга полиме-разной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ) и сканирования мутаций посредством DMA, но и в качестве блокирующих амплификацию агентов. Это позволило проводить «обогащенную» ПЦР мутантных аллелей и примерно в 10 раз повы-сить чувствительность их обнаружения [6].…”