Asymmetric PCR and DNA melting analysis with TaqMan probes applied for mutation detection is effectively used in clinical diagnostics. The method is simple, cost-effective, and carried out in a closed-tube format, minimizing time, labor, and risk of sample cross-contamination. Although DNA melting analysis is more sensitive than Sanger sequencing (mutation detection thresholds are ~5% and 15%-20%, respectively), it is less sensitive than more labor-intensive and expensive techniques such as pyrosequencing and droplet digital PCR. Here, we demonstrate that, under specially selected conditions of asymmetric PCR, TaqMan probes can play the role of blocking agents. Preferential blocking of the wild-type allele brings about enriched amplification of mutant alleles. As a result, an ~10-fold increase in the detection sensitivity for mutant and genes was achieved.
Scanning for mutations by DNA melting analysis (DMA) is based on asymmetric PCR followed by the melting of duplexes formed by single-stranded amplicons with TaqMan probes. The method is optimally suited for clinical genetic testing; it is easy to perform, high-throughput, and sensitive. The detection limit of mutant alleles by the DMA method is about 3%, which is much higher than the sensitivity of Sanger sequencing. In addition, the DMA method is realized in a closed-tube format, while 2-h assay is carried out in a single tube without any intermediate or additional procedures thereby minimizing the risk of cross contamination of the samples. The validation of the DMA method was performed by scanning for mutations of clinically significant genes KRAS, NRAS, BRAF, and PIK3CA in 324 DNA samples from tumors of patients with melanoma, colorectal and lung cancer. DNA was isolated either directly from tumor tissues, or from formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissues. The detected mutations were verified by Sanger sequencing. The spectra of mutations identified in each tumor type correspond to the literature data and, thus, validate the use of DMA.
1 НИИ канцерогенеза ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2 НИИ клинической онкологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 Контакты: Анатолий Владимирович Лихтенштейн alicht@mail.ru Цель исследования -оценка возможности применения высокочувствительного метода «обогащенной» полимеразной цепной реакции c последующим анализом плавления ДНК (DNA melting analysis) (ПЦР-DMA) для таргетной жидкостной биопсии у онкологических больных. Материалы и методы. Метод ПЦР-DMA использовали для мутационного сканирования онкогена KRAS (кодоны 12 и 13) в опухолевой ткани и в плазме крови 20 больных колоректальным раком. Результаты. Активированный онкоген обнаружен у 16 больных в самой опухоли и у 5 из них -в плазме крови (подтверждено секвенированием). В опухоли и плазме крови еще 2 больных при «обогащенной» ПЦР-DMA выявлено присутствие мутантных аллелей, но в крайне низкой концентрации, не позволявшей их идентифицировать методом Сэнгера. Таким образом, таргетная жидкостная биопсия в предлагаемом варианте оказалась успешной у 7 (~35 %) из 20 исследованных больных. С учетом того факта, что анализ плазмы крови пациентов проводили после многократных лечебных процедур, вызывающих массовую гибель опухолевых клеток, реальная эффективность данного метода может оказаться существенно выше. Ключевые слова: жидкостная биопсия, сканирование мутаций, плавление ДНК, KRAS Для цитирования: Ботезату И. В., Панчук И. О., Коломейцева А. А. и др. Таргетная жидкостная биопсия посредством «обогащенной» полимеразной цепной реакции и анализа плавления ДНК. Успехи молекулярной онкологии 2018;5(1):35-42. Objective: to evaluate the possibility of using a highly sensitive method of "enriched" polymerase chain reaction followed by DNA melting analysis (PCR-DMA) for target liquid biopsy of cancer patients. Materials and methods. The "enriched" PCR-DMA was used for mutation scanning of KRAS (codons 12 and 13) in tumor and blood plasma of 20 patients with colorectal cancer. Results. Activated oncogene was found in tumor tissue of 16 patients and in blood plasma of 5 patients (confirmed by sequencing). Mutant KRAS alleles were also found in tumor and plasma of another 2 patients, but in very low concentrations that did not allow their validation by Sanger sequencing. Thus, in our study the target liquid biopsy was successful in ~35 % patients. Since the plasma tests were carried out after repeated medical procedures causing mass death of tumor cells, the actual efficiency of this approach may appear significantly higher. For citation: Botezatu I. V., Panchuk I. O., Kolomeytseva A. A. et al. Target liquid biopsy using "enriched" polymerase chain reaction and DNA melting analysis. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2018;5(1):35-42.
Резюме. Натуральные киллеры (NK) и NKT-лимфоциты являются важными составляющими врожденного иммунитета и играют роль первой линии защиты от онкологических заболеваний. Данные популяции отличаются высокой гетерогенностью и разделяются на несколько субпопуля-ций, отличающихся по степени экспрессии маркеров CD56 и CD16 и функциональной активно-стью. Исследование гетерогенности данных популяций лимфоцитов у здоровых доноров актуаль-но, так как является основой для изучения нарушений баланса между различными субпопуляциями у онкологических больных. Изменения соотношения выше представленных субпопуляций могут обладать прогностическим и клиническим значением при опухолевых заболеваниях. Было проведе-но исследование лимфоцитов периферической крови 50 здоровых доноров. При анализе популяции NK-лимфоцитов было выявлено 18,0±11,3% антиген-положительных клеток, колебания значений составило от 7,6 до 29,2%, в то время как количество клеток с фенотипами CD3 dim CD16 dim , не содержащая внутриклеточный перфорин (2,0%). Популяция NKT-клеток с фенотипом СD3 + CD16/СD56 + вы-является в 7,1% (25% -3,45; 75% -8,75) антиген-положительных клеток в диапазоне от 2,5 до 11,9% и не подчиняется законам нормального распределения. При анализе с помощью комбинации МКА CD3/CD56/CD16 количество CD3 + CD56 + клеток составило 4,33% (25% -2,25; 75% -7,3), а коли-чество CD3 + CD16 + -3,087% (25% -0,9; 75% -6,2). Оказалось, что различия между определением с помощью тест-системы CD3/CD16/CD56 и с помощью CD3/CD16 является статистически значи- Россия, Москва, Каширское шоссе, 23. Тел.: 8 (962) 956-25-97.
В настоящее время перспективным направлением в иммунотерапии злокачественных опухолей является применение таргетных препаратов на основе моноклональных антител, направленных против ингибиторных рецепторов Т-клеток, так называемых «контрольных точек иммунитета». Одним из первых препаратов этой группы, введенных в клиническую практику, является Ипилимумаб (анти-CTLA-4). цель иследования-изучение взаимосвязи субпопуляционного состава циркулирующих лимфоцитов больных диссеминированной меланомой кожи в процессе терапии Ипилимумабом с клинической эффективностью лечения. Материалы и методы. Иммунофенотипирование циркулирующих лимфоцитов проводили методом многопараметрового цитометрического анализа с использованием коммерческих моноклональных антител к поверхностным антигенам CD45, CD4, CD8, CD19, CD16, CD56, CD25, CD127, CD11b. В исследование было включено 120 больных диссеминированной меланомой кожи. Иммунологическое обследование проводилось до и после 4-х введений Ипилимумаба (3 мг/кг каждый 21 день). Результаты. Проведенное исследование выявило связь исходного количества определенных популяций лимфоцитов периферической крови с продолжительностью жизни больных, леченных Ипилимумабом. Основные различия наблюдались между группой больных с максимальной продолжительностью жизни (более 2-х лет) и группами пациентов с продолжительностью жизни менее 2-х лет, и касались клеток адаптивного и врожденного иммунитета, как эффекторных (CD8 + , CD4 + Т-клетки, NK-клетки), так и регуляторных (NKT-клетки, CD8 + CD28 − и CD4 + CD25 high+ CD127 low/neg Т-клетки-супрессоры) популяций. Под влиянием терапии Ипилимумабом наиболее значительные изменения линейной структуры циркулирующих лимфоцитов также наблюдались у пациентов с продолжительностью жизни более 2-х лет.
scite is a Brooklyn-based organization that helps researchers better discover and understand research articles through Smart Citations–citations that display the context of the citation and describe whether the article provides supporting or contrasting evidence. scite is used by students and researchers from around the world and is funded in part by the National Science Foundation and the National Institute on Drug Abuse of the National Institutes of Health.
hi@scite.ai
10624 S. Eastern Ave., Ste. A-614
Henderson, NV 89052, USA
Copyright © 2024 scite LLC. All rights reserved.
Made with 💙 for researchers
Part of the Research Solutions Family.