Novas fases estacionárias à base de sílica para cromatografia líquida de alta eficiência

Abstract

Recebido em 20/3/03; aceito em 16/7/03 NEW STATIONARY PHASES BASED ON SILICA FOR HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY. The present work reviews recent advances in the preparation of new reversed phase packing materials such as sterically protected, bidentate, hybrid organic-inorganic and monolithic phases and phases containing embedded polar groups. The bonding chemistry involved in the preparation of these phases as well as their advantages over conventional C 8 and C 18 reversed phases are discussed. Understanding the reasons behind the development of these newer column packings helps analysts select the best stationary phase for a given application.Keywords: stationary phases; embedded phases; HPLC. INTRODUÇÃOApesar de existirem colunas recheadas com materiais poliméricos para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), a sílica é o material mais utilizado como suporte devido à sua alta estabilidade mecânica e térmica, rigidez e a grande eficiência obtida nas separações cromatográficas 1 . Na década de 70, quando a CLAE começou a ser desenvolvida, a sílica utilizada 2 apresentava forma irregular e tamanho de partícula de 40 µm. Por volta de 1980, foi substituída por partículas menores e de morfologia esférica. O próximo avanço 3 foi o uso de partículas com diâmetros cada vez menores, sendo que aquelas de 10 µm foram preferencialmente trocadas pelas de 5 e 3 µm. Atualmente, já existem colunas recheadas com partículas porosas de 1,6 micrômetros 4 . Também ocorreram mudanças significativas quanto à pureza das sílicas, principalmente no método de obtenção destes materiais porosos. A sílica, que antes era obtida diretamente do silicato de sódio, agora passa a ser preparada através do processo sol-gel, empregando o tetraetoxissilano como fonte de SiO 2 . Com a utilização de solventes e agentes surfactantes apropriados, sílicas de diferentes tamanhos e porosidades são obtidas 5 . Hoje é possível adquirir sílicas altamente puras, livres de contaminantes como ferro e alumínio. A presença desses metais M 3+ e outros, como contaminantes na matriz de sílica, aumenta consideravelmente a acidez dos grupos silanóis (≡Si-OH), dificultando a análise de compostos básicos em condições de fase reversa 6 . Essas melhorias no suporte cromatográfico permitiram ganhos significativos na eficiência, estabilidade e reprodutibilidade das colunas 7 . Alguns pesquisadores consideram que a modificação química da superfície da sílica parece não ter evoluído muito quando comparada com os métodos de obtenção da sílica, por ainda utilizar os mesmos organossilanos empregados há mais de trinta anos 8 . Entretanto, os pesquisadores engajados no desenvolvimento de novas colunas para CLAE conseguiram alguns melhoramentos para as fases quimicamente ligadas do tipo C 8 e C 18 , através da reação de capeamento ou bloqueio dos grupos silanóis 7 . Além da busca de novos materiais para serem utilizados como suporte cromatográfico e novos procedimentos de síntese para bloquear os silanóis residuais, novas fases estacionárias vêm sendo sintetizadas,...

O desafio de analisar solutos básicos por cromatografia líquida em modo reverso: algumas alternativas para melhorar as separações

“…Os mesmos silanóis que interagem com solutos básicos são os responsáveis pela instabilidade da sílica em meio alcalino, uma vez que os hidróxidos na fase móvel atacam os silanóis residuais, ocasionando a dissolução da sílica e a degradação da fase estacionária. 5,6,9,37,38,[72][73][74][75] Por sua vez, a sílica é um material extremamente estável em meio ácido, mas as ligações siloxano no ligante utilizado para modificar a sílica quimicamente (Si-C) são hidrolisadas em meio ácido. 5,6,9,37,38, 75,76 Estabilidade em fase móvel alcalina Os testes de estabilidade são feitos em condições semelhantes às condições comumente usadas (pH da fase aquosa entre 2 e 8, concentração de tampão entre 5 e 25 mmol/L e temperaturas entre 20 e 40 °C) ou em condições extremas para acelerar a degradação da fase estacionária (pH da fase aquosa extremamente ácido em 0,5 a 1,5 ou extremamente alcalino em 10 a 14, concentração de tampão de 50 a 200 mmol/L e temperaturas entre 23 e 150 °C), sendo que o primeiro caso representa melhor a estabilidade das fases estacionárias.…”

“…5,6,9,37,38, 75,76 Estabilidade em fase móvel alcalina Os testes de estabilidade são feitos em condições semelhantes às condições comumente usadas (pH da fase aquosa entre 2 e 8, concentração de tampão entre 5 e 25 mmol/L e temperaturas entre 20 e 40 °C) ou em condições extremas para acelerar a degradação da fase estacionária (pH da fase aquosa extremamente ácido em 0,5 a 1,5 ou extremamente alcalino em 10 a 14, concentração de tampão de 50 a 200 mmol/L e temperaturas entre 23 e 150 °C), sendo que o primeiro caso representa melhor a estabilidade das fases estacionárias. A degradação da fase estacionária é avaliada em função da passagem de fase móvel pela coluna, sendo representada em volumes de coluna (Vc) ou pelo tempo em que a fase móvel passa pela coluna 5,6,37,38,75 Muitas tentativas foram feitas para aumentar a estabilidade das fases estacionárias em condições alcalinas. A primeira, consistiu em aumentar o recobrimento da sílica; porém, não é possível funcionalizar 100% dos silanóis da sílica, mesmo após sucessivas reações de capeamento.…”

“…Temperaturas iguais ou maiores a 60 °C aumentam a solubilidade da sílica na fase móvel, inclusive em meio neutro. 5,6,9,37,38,59,73,74 Por exemplo, quando a fase estacionária Zorbax Rx-C18 é submetida a um teste de estabilidade com a fase móvel acetonitrila:tampão fosfato (pH 7; 250 mmol/L) 20:80 (v/v), praticamente nenhuma sílica é dissolvida quando o teste é feito a 40 °C, enquanto o teste feito a 60 °C resulta em uma dissolução acentuada da fase estacionária (Figura 11S, material suplementar). 74 No entanto, esta fase estacionária pode ser submetida ao mesmo teste a 60 °C com uma concentração de tris de 50 mmol/L sem que qualquer dissolução na sílica seja evidenciada; quando a concentração de tampão tris é aumentada para 250 mmol/L, a sílica começa a se dissolver, mas muito menos que nos testes que utilizavam fosfato a 50 e 250 mmol/L (Figura 12S, material suplementar).…”

“…26 Dos seis parâmetros avaliados com o teste de Tanaka, observa-se que o parâmetro CH 2 não é útil para avaliar as fases estacionárias devido ao seu baixo DPR, de apenas 9% (DPR alto significa que o parâmetro cromatográfico estudado varia consideravelmente de uma fase estacionária para outra). A hidrofobicidade (k Pe ) apresenta valores de DPR altos (74%) e, por isso, é útil para diferenciar as fases estacionárias, as fases estacionárias com grupos polares como diol, ciano e com grupo polar embutido têm seus valores de hidrofobicidade dentro do primeiro quartil (1,6), devido à menor hidrofobicidade destes ligantes, enquanto fases estacionárias do tipo C8 e C18 têm valores de hidrofobicidade dentro do quarto quartil (5,5). A seletividade estérica (T/O) tem DPR de 37,1% e, por isso, não é um parâmetro muito útil para diferenciar as fases estacionárias.…”

“…1,2 Por sua vez, mais de 70% dos fármacos disponíveis no mercado são bases e a RP-LC é a técnica mais utilizada para analisar solutos básicos, 1,3 mas alguns problemas acontecem quando solutos básicos são analisados por RP-LC e, por esta razão, esta revisão se dedica a apresentar estes problemas e a fornecer algumas alternativas para superá-los, contribuindo com outras revisões produzidas pelo nosso grupo de pesquisa a respeito da RP-LC. [4][5][6][7][8][9] Em RP-LC o principal objetivo é obter separação dos solutos, que é avaliada através da resolução (R s ), que determinada o grau de separação entre dois picos adjacentes. A resolução pode ser expressa em função da eficiência (N 2 ), da seletividade (α) e do fator de retenção do segundo pico (k 2 ), com a aproximação de que ambos os picos têm aproximadamente a mesma largura à meia altura.…”