Induction of Viable but Nonculturable State in Beer Spoilage Lactic Acid Bacteria

Abstract

Strong beer spoilage strains Lactobacillus lindneri DSM 20692 and Lactobacillus paracollinoides JCM 11969 T were repeatedly subcultured in degassed beer and their culturability on MRS agar was examined. As a result, the two strains were found to show decreased culturability, suggesting that the prolonged contact with beer reduces the culturability of beer spoilage lactic acid bacteria (LAB). After 30 subcultures in degassed beer, both strains were subjected to sublethal heat treatment. As a consequence, L. lindneri DSM 20692 and L. paracollinoides JCM 11969 T were no longer detectable on MRS agar despite the presence of 460 viable cells, indicating that the viable but nonculturable (VNC) states were induced for both strains. Problematically, the heat treated VNC strains were shown to exhibit beer spoilage ability, suggesting that spoilage incidents can occur without detection by culture media. It was also shown that, once acquired, the VNC states are stably maintained in beer without further heat treatment. These results suggest the possibility that beer spoilage LAB strains remain hidden in pitching yeast and work-in-process products without detection. Furthermore L. lindneri DSM 20692 and L. paracollinoides JCM 11969 T in VNC states were successfully stored at -80°C with 10% dimethylsulfoxide as a cryoprotectant and reconstituted in degassed beer without losing VNC characteristics. Taken together, these findings show that valuable bioresources can be acquired from culturable beer spoilage LAB strains and maintained for long-term storage as frozen culture stocks.

Brewing microbiology - Lactic Acid Bacteria and Cultivation Methods of Their Detection - Part III

“…jejich inkubace v odplyněném pivu s upraveným pH a opakované přeočko-vání v pravidelných intervalech do čerstvého odplyněného piva; metody mohou být různě modifi kované (Deng et al, 2015;Suzuki et al, 2006). Cílem těchto prací je zavedení metody, která by umožnila v podmínkách provozní pivovarské laboratoře detekovat bakterie vyskytující se ve stavu VBNC.…”

“…In studies that deal with lactic bacteria adapted to conditions in beer, VBNC is induced by e.g. incubation in degassed beer with adjusted pH and repeated inoculation at regular intervals into fresh degassed beer; the methods may be variously modifi ed (Deng et al, 2015;Suzuki et al, 2006). The aim of all these studies is to introduce a method that would allow detecting bacteria that exhibit the VBNC trait, under conditions of operational brewing laboratory.…”

“…Such strains need not grow e.g. on media containing beer, because they lost their ability to grow in the presence of bitter hops substances and alcohol during long-term storage under laboratory conditions (Suzuki et al, 2006). In the literature, the characteristic "diffi cult cultivation" described for some lactic bacteria is related to the adaptation of bacteria to a specifi c environment, in this case to beer.…”

Lactic acid bacteria and cultivation methods of their detection - Part I.

“…1)� Striktně aerobní mikroorganismy vyžadují pro svůj růst kyslík -ve zkumavce s půdou rostou ve svrchní části sloupce půdy (a); fakultativně anaerobní organismy jsou schopny "nastavit" svůj metabolismus (tj� respiratorní nebo fermentativní) podle dostupnosti kyslíku -ve sloupci půdy budou převažovat spíše u hladiny, neboť respirací získají více energie než fermentací (b); striktní anaerobi vyžadují prostředí bez kyslíku (kyslík je pro ně toxický) a ve zkumavce rostou ve spodní části sloupce (c); aerotolerantní anaerobi nepotřebují kyslík, ale tolerují ho, není pro ně toxický -ve zkumavce rostou v celém objemu sloupce půdy (d); mikroaerofilní organismy mají specifické požadavky na kyslík -potřebují ho, ale pouze v určitém koncentračním rozmezí, vysoké koncentrace kyslíku jsou pro ně toxické -ve zkumavce rostou ve svrchní části sloupce, nikoliv však přímo u hladiny (e) (Hogg, 2005)� Pro kultivaci bakterií mléčného kvašení jsou doporučovány anaerobní podmínky, které lze navodit např� použitím vyvíječe anaerobní atmosféry a inkubací ve vzduchotěsných nádobách ("anaerostatech", "anaerobních hrncích"), nebo přímou inkubací v CO 2 -inkubá-toru, kde je anaerobní atmosféry dosaženo přímo plynem z tlakové lahve� Kultivační teplota v rozmezí 25-30 °C vyhovuje většině mléč-ných bakterií vyskytujících se ve vzorcích z pivovarského prostředí� V metodikách EBC je jako optimální teplota doporučována 27±1 °C, anaerobní inkubace, doba inkubace 5-7 dní� I malé snížení kultivační teploty může vést k prodloužení lag-fáze a snížení růstové rychlosti bakterií a tím k prodloužení doby inkubace potřebné k vytvoření viditelných kolonií (Taskila et al�, 2011;European Brewery Convention, 2011)� Urychlení detekce mléčných bakterií ve vzorku umožňuje technika odečítání mikrokolonií -viditelné kolonie jsou tvořeny mnoha miliony buněk a dosažení velikosti kolonie viditelné pouhým okem (tedy "standardní technika") trvá u mléčných bakterií adaptovaných na pivo několik dní� Metoda odečítání mikrokolonií (viditelných pouze v mikroskopu) urychluje stanovení -mikrokolonie jsou obarveny vhodným fluorescenčním barvivem a pozorovány pod mikroskopem už během 1�-2� dne od inokulace� Kombinace techniky mikrokolonií se specifickou detekcí (např� fluorescenční in situ hybridizace se specifickými sondami) pak umožní i identifikaci pomalu rostoucích kontaminant do úrovně druhu během velmi krátké doby (Asano et al�, 2009)� V souvislosti s mikrobiologickými analýzami piva byla u někte-rých laktobacilů popsána obtížná kultivovatelnost, nebo tzv� "stav obtížné kultivace" (tzv� hard-to-culture state), či stav "životaschop-nosti ale nekultivovatelnosti" (tzv� VBNC; viable but nonculturable), který je indukován při naočkování bakterií z piva na médium neobsahující pivo, a souvisí s adaptací bakterií na podmínky v pivu� Při opakovaném přeočkování na půdě bez piva postupně narůstá jejich schopnost růstu na běžné půdě, jak bylo zjištěno např� u L. lindneri, L. paracollinoides a L. acetotolerans (Deng et al�, 2014;Suzuki et al�, 2004;2006a)� Tzv� VBNC fenotyp, který je charakterizován neschopností buněk množit se na růstovém médiu, přestože jsou živé a udržují si metabolickou aktivitu, je běžným jevem a vyskytuje se u bakterií, které jsou vysoce adaptované na podmínky prostředí, v němž se vyskytují před přenesením na standardní živnou půdu (Oliver, 2005)� V článku je často popisována schopnost mléčných bakterií kazit pivo� Pokud uvádíme termín "škodlivost", je i tímto ...…”

Sake and Beer Spoilage Lactic Acid Bacteria - A Review

“…Interestingly, recent studies have shown that repeated passages in beer gradually reduce the culturability of originally easy-tocultivate strains of L. lindneri and L. paracollinoides, eventually leading to the acquisitions of hard-to-cultivate strains that mimic the state of primary isolates of these species 103,105 . Strikingly, it was observed that highly adapted strains of beer spoilage L. lindneri and L. paracol- linoides die swiftly on MRS agar (Fig.…”