Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins

Abstract

T-cell genome engineering holds great promise for cell-based therapies for cancer, HIV, primary immune deficiencies, and autoimmune diseases, but genetic manipulation of human T cells has been challenging. Improved tools are needed to efficiently “knock out” genes and “knock in” targeted genome modifications to modulate T-cell function and correct disease-associated mutations. CRISPR/Cas9 technology is facilitating genome engineering in many cell types, but in human T cells its efficiency has been limited and it has not yet proven useful for targeted nucleotide replacements. Here we report efficient genome engineering in human CD4+ T cells using Cas9:single-guide RNA ribonucleoproteins (Cas9 RNPs). Cas9 RNPs allowed ablation of CXCR4, a coreceptor for HIV entry. Cas9 RNP electroporation caused up to ∼40% of cells to lose high-level cell-surface expression of CXCR4, and edited cells could be enriched by sorting based on low CXCR4 expression. Importantly, Cas9 RNPs paired with homology-directed repair template oligonucleotides generated a high frequency of targeted genome modifications in primary T cells. Targeted nucleotide replacement was achieved in CXCR4 and PD-1 (PDCD1), a regulator of T-cell exhaustion that is a validated target for tumor immunotherapy. Deep sequencing of a target site confirmed that Cas9 RNPs generated knock-in genome modifications with up to ∼20% efficiency, which accounted for up to approximately one-third of total editing events. These results establish Cas9 RNP technology for diverse experimental and therapeutic genome engineering applications in primary human T cells.

Is autoimmunity the Achilles' heel of cancer immunotherapy?

“…Epigenetic and transcriptional mechanisms determine the functional plasticity of T cells to switch between their exhausted and effector states 62 , and so altering the transcriptional landscape-for example, by manipulating transcription-factor and gene-enhancer expression-and epigenetic landscape-for example, by manipulating the activity of histone-modifying methylation or demethylation enzymes, histone acetylases, and DNA demethylases-of adoptively transferred T cells may yield a more specific anti-tumor response than generalized PD-1 and CTLA-4 blockade. Genomic editing of chimeric antigen receptor (CAR) T cells to render them resistant to exhaustion has been proposed 63,64 , and Sen and colleagues suggested that mapping state-specific enhancers in exhausted T cells could enable more precise genome editing for adoptive T cell therapy 62 .…”

“…These attempts to create checkpoint-resistant T cells are likely to increase both their general efficacy and autoantigen-mediated effects 63,64,102 . Thus, controlling potential off-target effects of CAR and TCR-transduced T cells will depend on choosing an appropriate tumor-specific antigen, eliminating the endogenous TCR, engineering CAR T cells reliant on multiple tumor-associated antigens for activation 103 , and inserting suicide genes, such as iCaspase-9 or other regulated receptors 75 , that allow for quick inactivation in the event of off-target effects.…”

Les débuts de CRISPR en thérapie génique

“…Après coupure de l'ADN en ce point par la nucléase Cas9, la réparation se fera par jonction non homologue (NHER, non-homologous end joining), inactivant ainsi le gène PD-1. En fait les auteurs comptent aussi introduire deux autres ARNg destinés à inactiver les gènes des chaînes alpha et bêta des récepteurs T préexistants dans la cellule, de manière à ce que le seul récepteur T exprimé soit celui qui est dirigé contre NY-ESO-1 5 . Ils prévoient de traiter ainsi des malades présentant un sarcome, un myélome récidivant ou un mélanome, le but de ce premier essai étant de tester la faisabilité pratique de ces manipulations et la sécurité pour les patients.…”

“…Et toutes ces manipulations devront être répétées pour chaque malade puisqu'il faut le traiter avec ses propres cellules. Notons que cela fait fort peu de temps que l'on sait utiliser le système CRISPRCas9 pour des lymphocytes T : les premières démonstrations datent d'un an à peine [5,6]. Comme l'efficacité de la correction du génome (genome editing) n'est pas de 100 %, et que les trois modifications introduites sont 4 CTLA-4 est un régulateur négatif de la réponse T. Il entre en compétition avec le co-récepteur activateur CD28, vis-à-vis de CD80 et CD86.…”

“…Comme l'efficacité de la correction du génome (genome editing) n'est pas de 100 %, et que les trois modifications introduites sont 4 CTLA-4 est un régulateur négatif de la réponse T. Il entre en compétition avec le co-récepteur activateur CD28, vis-à-vis de CD80 et CD86. 5 En fait, contre un peptide dérivé de la protéine NY-ESO-1 présentée dans le contexte HLA-A2 (human leukocyte antigens) de la cellule. On ne peut donc utiliser cette approche que sur des patients possédant cet allèle, qui est heureusement très fréquent.…”