Detection of the Bean Common Blight Bacteria,Xanthomonas campestrispv.phaseoliandX. c. phaseolivar.fuscans,Using the Polymerase Chain Reaction

Audy, Patrice; Laroche, André; Saindon, G.; Huang, Hung‐Chang; Gilbertson, R. L.

doi:10.1094/phyto-84-1185

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“…O par de primers utilizado apresentou-se eficiente na identificação de Xap e Xapf (Figura 1), após a adaptação do protocolo utilizado por Audy et al (1994), uma vez que a temperatura de anelamento a 65 o C, utilizada pelos autores, não permitiu a repetibilidade dos resultados, ora havendo amplificação, ora não.…”

Section: Resultsunclassified

“…Este efeito da temperatura na capacidade de amplificação foi observado por Audy et al (1996) e demonstrado neste estudo, para o isolado Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que estes primers apresentam boa capacidade para identificação de Xap e Xapf, embora dois dos isolados aqui estudados não tenham sido detectados. O fato destes, embora patogê-nicos, não terem sido amplificados, demonstra que pode não existir relação entre esta propriedade e a presença de banda, como sugerido por Audy et al (1994). …”

Section: Resultsunclassified

“…As amplificações foram conduzidas em volume total de 50 µl, consistindo de 5 µl de tampão de PCR 10x; 3 µl de MgCl 2 25 mM; 1 µl de dNTP mix 10 mM; 1µl de cada primer (X4c (GGC AAC ACC CGA TCC CTA AAC AGG) 62,89 nmoles/ml e X4e (CGC CGG AAG CAC GAT CCT CGA AG) 66,59 nmoles/ml); 0,5 µl de Taq DNA polimerase 5 u/ µl; 5 µl da cultura em meio 523 de Kado & Heskett (Kado & Heskett, 1970) Para confirmar os resultados obtidos para dois dos isolados, foi reduzida somente a temperatura de anelamento, para 50 e 45 o C (adaptado de Audy et al, 1994).…”

Section: Pcr Com Primers Específicosunclassified

“…Com o objetivo de verificar a eficiência da técnica de PCR na identificação de isolados de Xap e Xapf, provenientes de diferentes regiões produtoras de feijão do Brasil, foram utilizados dois primers considerados específicos para este patógeno (Audy et al, 1994;Audy et al, 1996), visando sua posterior adequação a um sistema de rotina de diagnose.…”

Section: Introductionunclassified

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Identificação de xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e x. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans através da técnica de pcr

et al. 2001

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Este trabalho teve por objetivo verificar a viabilidade de utilização da técnica de PCR, usando primers considerados específicos, para identificação de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) e X. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf), visando criar bases para sua utilização em diagnose rotineira e em programas de certificação de sementes. Foram incluídos no estudo 42 isolados da bactéria provenientes de locais distintos, além de outros gêneros, espécies e patovares, para ser verificada a especificidade dos primers. Os resultados obtidos permitem concluir que os primers utilizados são adequados para identificação de Xap e Xapf, embora dois isolados patogênicos não tenham sido amplificados. Foi observada também a amplificação de uma banda fraca para X. axonopodis pv. vitians, com o mesmo número de pares de bases, o que sugere existir homologia entre estes patovares, na região amplificada.Palavras-chave adicionais: Phaseolus vulgaris, crestamento bacteriano do feijoeiro, caracterização molecular.The objective of this study was to determine the availability of PCR technique as a tool for Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) and X. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf) identification. The specificity of the primers was tested based on the DNA amplification of 42 isolates of bacteria collected at several locations. The primers were capable of identifying Xap and Xapf, although two virulent isolates were not detected. The amplification of a weak band, which was observed for X. axonopodis pv. vitians, suggests homology between these pathovars, in the same region. ABSTRACTIdentification of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli and X. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans through the PCR technique INTRODUÇÃO

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Section: Resultsunclassified

Section: Pcr Com Primers Específicosunclassified

Section: Introductionunclassified

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Identificação de xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e x. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans através da técnica de pcr

et al. 2001

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“…For detection and identification of Xap, PCRamplification methods have also been described (Audy et al, 1994;Toth et al, 1998). In general, PCR assays are rapid and highly specific, but quantification is difficult and amplification is prone to inhibition by contaminants present in seed samples (Van der Wolf & Schoen, 2004).…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli in bean seeds by flow cytometry, immunostaining and direct viable counting

Tebaldi¹,

Peters²,

Souza³

et al. 2010

Trop. plant pathol.

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Flow cytometric analysis of immuno-stained cells (immuno-FCM) was compared to immunofluorescence microscopy (IF) and dilution plating on a semi-selective medium, for quantitative detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) in bean seed extracts. Cell concentrations of Xap between 10 3 -10 7 CFU/mL were added to healthy bean seed extracts. A flow cytometry sorting procedure was developed to separate immuno-stained Xap cells from crude seed extracts and confirming by PCR. FCM was evaluated for direct viable counting (DVC) of Xap using combinations of propidium iodide (PI) and carboxy fluorescein diacetate (cFDA) or PI and SYTO 9 and also the combination of immuno-FCM and PI. Dilution plating and IF allowed detection of Xap in bean seed extracts in a range of 10 3 -10 6 CFU/mL and immuno-FCM from 10 4 -10 6 CFU/mL. Sorted cells could be detected in crude seed extracts by PCR without further extraction. FCM also allowed quantification of viable cells of Xap after DVC procedures; the red fluorescent dye propidium iodide was used to identify dead cells in combination with the green fluorescent dyes cFDA or SYTO 9, these identifying live cells. The combination of immuno-FCM and PI could be more promising and reliable to detect this pathogen in seeds. Key words: seed pathology, flow sorting, PCR-amplification, viability probes, immunofluorescence, bacteria. RESUMO Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão usando citometria de fluxo em combinação com anticorpo e sondas fluorescentes de viabilidadeA combinação do uso do citômetro de fluxo (FCM) e de anticorpo policlonal (imuno-FCM) foi comparada à microscopia de imunofluorescência (IF) e ao plaqueamento em meio de cultura semi-seletivo, para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em sementes de feijão. Concentrações de Xap variando de 10 3 a 10 7 CFU/mL foram adicionados aos extratos de sementes. Um método de separação pelo citômetro de fluxo foi desenvolvido para a detecção de Xap em extratos de semente e posterior confirmação por PCR. Para avaliação da viabilidade das células foram usadas sondas fluorescentes, iodeto de propídio (PI)/carboxi diacetato de fluoresceína (cFDA) e PI/SYTO 9 e também, a combinação de imuno-FCM e PI. Em meio semi-seletivo e IF foram detectadas 10 3 -10 6 UFC/mL e no FCM 10 4 -10 6 UFC/mL, em extratos de sementes artificialmente infestados. Xap somente foi detectada em extratos de sementes por PCR, após o processo de separação pelo FCM. Foi possível pelo FCM a quantificação e identificação de células viáveis (verde fluorescente) e células mortas (vermelho fluorescente) de Xap, pelas sondas cFDA/SYTO 9 e PI, respectivamente. A combinação de immuno-FCM e PI poderá ser uma técnica promissora e segura para a detecção deste patógeno em sementes. Palavras-chave: patologia de sementes, PCR, sondas de viabilidade, imuno-fluorescência, bactéria. INTRODUCTIONXanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith) Vauterin, Hoste, Kersters & Swinges (Xap) is a seedtransmitted plant-pathogenic bacterium w...

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Plant disease diagnosis

Fox

Narra

The Epidemiology of Plant Diseases

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Detection of the Bean Common Blight Bacteria,Xanthomonas campestrispv.phaseoliandX. c. phaseolivar.fuscans,Using the Polymerase Chain Reaction

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Identificação de xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e x. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans através da técnica de pcr

Identificação de xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e x. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans através da técnica de pcr

Detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli in bean seeds by flow cytometry, immunostaining and direct viable counting

Plant disease diagnosis

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