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Human cadaveric skin allografts are used in the treatment of burns and can be preserved in glycerol at high concentrations. Previously, glycerol has been attributed some antimicrobial effect. In an experimental set-up, we aimed at investigating this effect of prolonged incubation of bacteria in 85% glycerol. Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Bacillus subtilis were incubated in 85% glycerol. The influence of duration of incubation and temperature on ultrastructure and viability were investigated. Unstressed cultures served as controls. Survival was studied after 24-36 h and 10 days incubation in 85% glycerol at 48C and 368C with transmission electron microscopy~TEM! and flow cytometry using viability stains indicating membrane damage~SYTO9, propidium iodide! or esterase activity~carboxyfluores-cein diacetate!. TEM clearly demonstrated variability in morphological changes of bacteria suggesting different mechanisms of damage. Viability stains supported these findings with faster declining viable cell populations in 85% glycerol at 368C compared with 48C. Both methods demonstrated that Gram-negative species were more susceptible than Gram-positive species. In conclusion, 85% glycerol may have some additional antimicrobial effect. Temperature is an important factor herein and Gram-negatives are most susceptible. The latter finding probably reflects the difference in cell wall composition between Gram-positive and Gram-negative bacteria.

Melon and watermelon bacterial fruit blotch, incited by Acidovorax citrulli, is limited to some areas in Brazil but causes important losses, mainly in melon-producing regions. Although genetic diversity has been observed among strains belonging to the species, they are considered a homogeneous group based on the fact that they show only slight physiological or nutritional differences. The objective of this study was to compare Brazilian strains from melon and watermelon by means of biochemical, pathogenicity, serological and molecular assays. Fifteen biochemical tests, cross inoculation between strains and hosts, ELISA and repetitive sequence analysis (rep-PCR) with the primers REP, ERIC and BOX were conducted. No differences were revealed by nutritional characterization or serology, but cross inoculation showed different pathogenicity groups, which could explain high aggressiveness of the bacteria to melon crops in some regions. Molecular analysis by BOX-PCR clustered strains according to their geographical origin, while ERIC-and REP-PCR, analyzed together, indicated genetic diversity, but without geographical or host origin relationships. One test that could be used to verify the pathogenicity of strains by inoculating detached leaf petioles, showing results in 36 h, is proposed here.

ABSTRACT:Ralstonia solanacearum is a gram-negative soil-borne bacterium capable of infection of hundreds of vegetable species over more than 50 botanical families, causing bacterial wilt, except for bananas, when the disease is called Moko. It deserves special attention, from all other plant pathogenic bacteria, for its high phenotypic and genotypic plasticity, a characteristic that makes disease control extremely difficult. In this context, frequent and necessary surveys are conduct in the attempt of characterizing the prevailing strains of R. solanacearum in each region where the disease has been reported. However, knowledge about occurrence and diversity of R. solanacearum in Brazil is fragmented and in some cases, based on inconclusive studies with few strains, little representative of a given region. The need to obtain a greater picture guided this review. The occurrence of this bacterium in Brazilian States and the possible causes for its dissemination are presented, with emphasis on studies of genetic variability of populations of R. solanacearum in the country. The compiled results report a wide distribution of the bacterium in Brazil and great variability of its populations among locations. Partly due to the difficulty of detecting small titer of bacteria in samples, paucity of information about the origin of inoculum in certain regions is observed, as well as the need for detecting the presence of the pathogen in asymptomatic plants, potato tubers with latent infections, soil, and water, which are the major causes of bacterial dissemination into areas without any disease history.

Flow cytometric analysis of immuno-stained cells (immuno-FCM) was compared to immunofluorescence microscopy (IF) and dilution plating on a semi-selective medium, for quantitative detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) in bean seed extracts. Cell concentrations of Xap between 10 3 -10 7 CFU/mL were added to healthy bean seed extracts. A flow cytometry sorting procedure was developed to separate immuno-stained Xap cells from crude seed extracts and confirming by PCR. FCM was evaluated for direct viable counting (DVC) of Xap using combinations of propidium iodide (PI) and carboxy fluorescein diacetate (cFDA) or PI and SYTO 9 and also the combination of immuno-FCM and PI. Dilution plating and IF allowed detection of Xap in bean seed extracts in a range of 10 3 -10 6 CFU/mL and immuno-FCM from 10 4 -10 6 CFU/mL. Sorted cells could be detected in crude seed extracts by PCR without further extraction. FCM also allowed quantification of viable cells of Xap after DVC procedures; the red fluorescent dye propidium iodide was used to identify dead cells in combination with the green fluorescent dyes cFDA or SYTO 9, these identifying live cells. The combination of immuno-FCM and PI could be more promising and reliable to detect this pathogen in seeds. Key words: seed pathology, flow sorting, PCR-amplification, viability probes, immunofluorescence, bacteria. RESUMO Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão usando citometria de fluxo em combinação com anticorpo e sondas fluorescentes de viabilidadeA combinação do uso do citômetro de fluxo (FCM) e de anticorpo policlonal (imuno-FCM) foi comparada à microscopia de imunofluorescência (IF) e ao plaqueamento em meio de cultura semi-seletivo, para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) em sementes de feijão. Concentrações de Xap variando de 10 3 a 10 7 CFU/mL foram adicionados aos extratos de sementes. Um método de separação pelo citômetro de fluxo foi desenvolvido para a detecção de Xap em extratos de semente e posterior confirmação por PCR. Para avaliação da viabilidade das células foram usadas sondas fluorescentes, iodeto de propídio (PI)/carboxi diacetato de fluoresceína (cFDA) e PI/SYTO 9 e também, a combinação de imuno-FCM e PI. Em meio semi-seletivo e IF foram detectadas 10 3 -10 6 UFC/mL e no FCM 10 4 -10 6 UFC/mL, em extratos de sementes artificialmente infestados. Xap somente foi detectada em extratos de sementes por PCR, após o processo de separação pelo FCM. Foi possível pelo FCM a quantificação e identificação de células viáveis (verde fluorescente) e células mortas (vermelho fluorescente) de Xap, pelas sondas cFDA/SYTO 9 e PI, respectivamente. A combinação de immuno-FCM e PI poderá ser uma técnica promissora e segura para a detecção deste patógeno em sementes. Palavras-chave: patologia de sementes, PCR, sondas de viabilidade, imuno-fluorescência, bactéria. INTRODUCTIONXanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith) Vauterin, Hoste, Kersters & Swinges (Xap) is a seedtransmitted plant-pathogenic bacterium w...

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RESUMO Os genótipos de soja utilizados para a alimentação humana são suscetíveis a Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag). A bactéria é transmitida pelas sementes e apresenta difícil controle, justificando a necessidade de realizar testes de sanidade de sementes antes da comercialização ou semeadura. Os meios de cultura para a detecção da bactéria em sementes devem ser práticos, rápidos e sensíveis. O objetivo do trabalho foi detectar a presença de Xag em sementes de soja, em meio de cultura semi-seletivo. Nos meios de cultura de semi-seletivo MXG com e sem antibióticos e de rotina 523 foi cultivada a suspensão bacteriana (109 UFC mL-1, OD550 = 0,5), diluída em série (10-1 a 10-7), do isolado UFU C35 de Xag, em placas de Petri com 3 repetições para cada diluição. Após 4 dias foi quantificado o número de unidades formadoras de colônias por mL (UFC mL-1). A análise estatística foi realizada a partir do teste Kruskal-Wallis. Para detecção da bactéria nas sementes de soja foram avaliados cinco genótipos: 0012.UB010/11-P, 0012.UB1501/11-P, 0012.UB037/11-P, 0012.UB003/11-P e NT12 Paraná. Em Erlenmeyer foram colocadas 100 g de sementes e adicionados 200 mL de solução salina 0,85%, incubados na geladeira por 18 h. Os extratos das sementes foram diluídos em série (10-1 a 10-2) e cultivados nos meios de cultura MXG com antibióticos e 523, com 6 repetições para cada diluição e incubados a 28 oC. Após 4 dias foi quantificado o número de UFC g-1 de sementes. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. O meio de cultura semi-seletivo MXG com e sem antibióticos não inibiu o desenvolvimento de Xag e o meio MXG com antibióticos foi eficiente para detecção da bactéria em sementes de soja de todos os genótipos avaliados, podendo ser usado em análises de rotina.

RESUMO A mancha bacteriana do tomateiro, causada por quatro espécies de Xanthomonas pode provocar perdas significativas na produção da cultura e a utilização de biofertilizantes na proteção de plantas tende a reduzir a incidência de doenças. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito dos biofertilizantes no controle preventivo e curativo da mancha bacteriana do tomateiro. Para o controle preventivo da doença, plantas de tomate cultivar Santa Cruz Kada, com 3 a 4 folhas foram pulverizadas com os biofertilizantes (Soil-Set, Agro-Mos e Cop-R-Quick) e água (testemunha); e dois dias após foram inoculadas por aspersão com a suspensão bacteriana nas concentrações 109 UFC mL-1 (OD550=0,5) e 106UFC mL-1, com o isolado UFU A35 de Xanthomonas sp. Para o controle curativo, as plantas foram inoculadas com a suspensão bacteriana, e dois dias após foram pulverizadas com os biofertilizantes e água. A severidade da mancha bacteriana foi avaliada usando uma escala diagramática; aos 3, 5, 8, 11 e 14 dias após a inoculação e calculada a área abaixo da curva de progresso de doença (AACPD). O controle preventivo foi mais eficiente no manejo da mancha bacteriana do tomateiro, e os diferentes biofertilizantes reduziram a severidade da doença.