Litter broiler dapat dimanfaatkan sebagai pakan alternatif ruminansia karena kandungan nutrien yang masih baik. Penelitian bertujuan mengkaji produksi protein total dan kecernaan protein dari litter broiler fermentasi dengan lama inkubasi yang berbeda secara in vitro. Rancangan percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan 4 ulangan. Perlakuan lama inkubasi adalah T0 = fermentasi 0 minggu (0 hari), T1 = fermentasi 3 minggu (21 hari), T2 = fermentasi 6 minggu (42 hari), dan T3 = fermentasi 9 minggu (63 hari). Parameter penelitian meliputi produksi protein total dan kecernaan protein litter broiler. Hasil penelitian menunjukan bahwa perlakuan lama fermentasi yang berbeda memberikan pengaruh berbeda nyata (p<0,05) terhadap produksi protein total dan kecernaan protein kasar. Produksi protein total litter broiler berturut-urut T0, T1, T2, dan T3 adalah 666 mg/g, 822 mg/g, 914 mg/g, dan 934 mg/g. Kecernaan protein litter broiler berturut-urut T0, T1, T2, dan T3 adalah 47%, 51,3%, 53,2% dan 53%. Kesimpulan dari penelitian adalah semakin lama inkubasi litter broiler fermentasi meningkatkan produksi protein total dan kecernaan protein. Fermentasi litter broiler terbaik pada lama inkubasi 6 minggu.