Construção e aplicação de biossensores usando diferentes procedimentos de imobilização da peroxidase de vegetal em matriz de quitosana

Abstract

Recebido em 16/5/05; aceito em 3/11/05; publicado na web em 31/3/06 CONSTRUCTION AND ANALYTICAL APPLICATIONS OF BIOSENSORS USING DIFFERENT IMMOBILIZATION PROCEDURES OF VEGETABLE PEROXIDASE ON CHITOSAN MATRIX. Biosensors were developed by immobilization of gilo (Solanum gilo) enzymatic extract on chitosan biopolymers using three different procedures: glutaraldehyde, carbodiimide/ glutaraldehyde and epichlorohydrin/glutaraldehyde. The best biosensor performance was obtained after the immobilization of peroxidase on chitosan with epichlorohydrin/glutaraldehyde. Linear analytical curves for hydroquinone concentrations from 2.5x10 -4 to 4.5x10 -3 mol L -1 with a detection limit of 2.0x10 -6 mol L -1 and recovery of hydroquinone ranging from 95.1 to 105% were obtained. The relative standard deviation was < 1.0 % for a solution of 3.0x10 -4 mol L -1 hydroquinone and 2.0x10 -3 mol L -1 hydrogen peroxide in 0.1 mol L -1 phosphate buffer solution at pH 7.0 (n=8). The lifetime of this biosensor was 6 months (at least 300 determinations).Keywords: chitosan; biosensor; peroxidase. INTRODUÇÃODesde o desenvolvimento do primeiro biossensor, em 1962, diversos outros foram construídos utilizando diferentes enzimas e procedimentos de imobilização. Apresentam características importantes, tais como seletividade, baixo custo e facilidade na construção, potencial para miniaturização, resposta rápida, potencial de automação e construção de equipamentos simples e portáteis 1 . Um biossensor pode ser definido como um sensor que combina a alta seletividade de um elemento biológico sensível ao analito de interesse, ligado a um transdutor que converte o sinal biológico em sinal elétrico proporcional à concentração do analito 1-8 . O desenvolvimento de técnicas de imobilização tem sido importante por proporcionar a reutilização das enzimas, aumentar a estabilidade, reduzir custos e aumentar, em alguns casos, a atividade enzimática. Esses fatores dependem principalmente da escolha apropriada do suporte e dos reagentes utilizados no processo de imobilização 2-10 . Os métodos de imobilizações podem ser divididos nas seguintes categorias: oclusão em gel, microencapsulação, adsorção física, ligação química covalente e ligação química covalente cruzada. O método da ligação química covalente cruzada é muito utilizado e baseia-se na formação de ligações covalentes entre as moléculas da enzima e/ou do suporte inerte com reagentes funcionais. O glutaraldeído, em função de suas propriedades bifuncionais, tem sido um dos reagentes mais empregado na imobilização de enzimas, devido à formação de ligações covalentes entre a enzima e o suporte sólido, conferindo à enzima maior estabilidade. No entanto, há relatos na literatura da utilização de vários reagentes no processo de imobilização, entre eles, diazobenzidina, carbodiimida, ácido bisdiazobenzidínico, triclorotriazina 2-10 . O eletrodo de pasta de carbono proposto por Adams, em 1958, é uma composição de pó de grafite e de um líquido orgânico imiscível em solução aquosa 11 . Esse eletrodo oferece versat...

Imobilização da lacase em micropartículas de quitosana obtidas por spray drying e usadas na construção de biossensores

“…Em seguida, adicionaram-se 75 mg de Nujol e macerou-se por mais 20 min. A pasta obtida foi transferida para uma seringa de 1 mL e um fio de cobre foi usado como contato elétri-co. [10][11][12][13] Os biossensores foram armazenados a temperatura ambiente e aplicados como eletrodos de trabalho.…”

“…[10][11][12][13][14][42][43][44] A Figura 3 mostra uma proposta da imobilização da lacase em quitosana (a) reticulada com TPP (b) baseada na literatura. [10][11][12][13][14][42][43][44] O TPP é um íon pentavalente e reage com a quitosana formando ligações iônicas entre as cargas negativas dos oxigênios do TPP (P 3 O 10 5-) com os grupos amino protonados da quitosana (NH 3 + ) em valores de pH menores que 6,5, obtendo-se a estrutura representada em (c). Sugere-se que neste processo a lacase (d) esteja entrapeada entre as ligações iônicas da quitosana e do TPP, resultando na estrutura apresentada em (e).…”

“…Os biossensores desenvolvidos a partir da reticulação da quitosana com TPP e com glioxal, contendo lacase imobilizada, apresentaram maior estabilidade e sensibilidade, quando comparados com os biossensores empregando quitosana reticulada com outros agentes de reticulação. [10][11][12][13] Repetibilidade, reprodutibilidade entre sensores, estabilidade e seletividade O estudo da repetibilidade foi feito individualmente, utilizandose os biossensores propostos e 9 medidas sucessivas em solução de rutina 2,0x10 -6 mol L -1 em tampão acetato 0,1 mol L -1 (pH 4,0) foram obtidas. O desvio padrão relativo encontrado foi menor que 1,0% para os biossensores construídos.…”

“…7,8 A quitosana, (β(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glicose), possui um grupo amino primário e dois grupos hidroxila livres em cada unidade glicosamina, que podem ser modificados por agentes reticulantes. [6][7][8][9][10][11][12][13][14] Ligações do tipo base de Schiff são formadas entre os grupos amino da quitosana e os grupos aldeídos de agentes reticulantes, tais como glutaraldeído, glioxal, D,L gliceraldeído, formaldeído, entre outros. [6][7][8][9][10][11][12][13][14] Tem sido demonstrado que as imobilizações de enzimas por ligação covalente aumentam a resistência à desnaturação em condições extremas de pH, temperatura ou, ainda, em alguns casos, em presença de solventes orgânicos.…”

“…[6][7][8][9][10][11][12][13][14] Ligações do tipo base de Schiff são formadas entre os grupos amino da quitosana e os grupos aldeídos de agentes reticulantes, tais como glutaraldeído, glioxal, D,L gliceraldeído, formaldeído, entre outros. [6][7][8][9][10][11][12][13][14] Tem sido demonstrado que as imobilizações de enzimas por ligação covalente aumentam a resistência à desnaturação em condições extremas de pH, temperatura ou, ainda, em alguns casos, em presença de solventes orgânicos. 7,8 Outro processo de ativação da quitosana é realizado em meio áci-do, sendo os grupos amino da quitosana protonados e essas cargas positivas formadas podem interagir com diversos ânions como, por exemplo, tripolifosfato de sódio, sulfato de sódio, citrato de sódio, alginato de sódio, entre outros.…”