Este trabalho descreve a padronização de metodologia de análise CLAE para identificação e separação dos aminoácidos glicosilados (blocos de construção) 3, 4, 7 e 8, e seus respectivos precursores. Os aminoácidos glicosilados, contendo unidades de açúcar β-D-GlcNAc (3 e 7) Oligadas a aminoácidos de treonina estão envolvidos em eventos de sinalização celular, e os correspondentes isômeros 4 e 8, contendo unidades de α-D-GlcNAc, estão relacionados a Oglicanas encontradas em mucinas do parasita Trypanosoma cruzi. A metodologia desenvolvida é vantajosa e eficiente, pois permite a análise de misturas reacionais brutas, evitando exaustivos processos de purificação.This work describes the standardization of HPLC analysis methodology for the identification and separation of the glycosylated amino acids (building blocks) 3, 4, 7 and 8 and their respective precursors. The glycosylated amino acids containing the sugar units β-D-GlcNAc (3 and 7) Olinked to threonine amino acids are involved in cellular signalling events, and the correspondent isomers 4 and 8, possessing α-D-GlcNAc units are related to O-glycans found in mucins of the parasite Trypanosoma cruzi. The developed methodology is advantageous and efficient as it permits the analysis of crude reaction mixtures, avoiding exhaustive purification processes.