Genotipagem De Clostridium Perfringens Isolados De Leitões Diarréicos

Abstract

RESUMO Clostridium perfringens é o agente responsável pela enterite necrótica em leitões, caracterizada por diarréia, perda de peso e morte. O presente estudo objetivou a tipificação de C. perfringens a partir de fezes de leitões diarréicos pela técnica da PCR multiplex, utilizando iniciadores específicos para os genes das toxinas alfa (cpa), beta (cpb), beta-2 (cpb-2), épsilon (etx), iota (ia) e enterotoxina (cpe). Foram utilizadas 65 amostras fecais de leitões com idade variando entre sete a 36 dias. O material foi semeado em ágar gema de ovo com cicloserina. Colônias sugestivas de C. perfringens foram submetidas à coloração pelo método de Gram e caracterização bioquímica. Após certificado o crescimento e pureza, os clostrídios foram subcultivados em ágar sangue. Os extratos de DNA para amplificação da PCR foram obtidos por lise direta de uma colônia isolada, não sendo realizada a purificação do DNA. Bacilos anaeróbicos Gram-positivos foram isolados de 59 das 65 amostras fecais testadas. Vinte e sete foram identificadas como C. perfringens e tipificadas, sendo 21 (77,8%) do tipo A, cinco destas apresentavam o gene cpb-2; cinco (18,5%) eram do tipo C, quatro destas apresentavam o gene cpb-2; uma amostra (3,7%) era do tipo D e nenhuma foi positiva para o gene iA ou cpe. Neste estudo Clostridium perfringens tipo A foi o mais prevalente em fezes de leitões diarréicos.

Occurrence of Clostridium perfringens in Wild Mammals in the Amazon Biome

“…For each plate, up to three characteristic colonies containing sulfite-reducing microorganisms were suspended in 400 μL of ultrapure water (Milli-Q®) in Eppendorf tubes (2 ml) and subjected to thermal DNA extraction at 98 °C for 20 min in a thermoblock (HDV, BR) [15,16]. Subsequently, the microtubes were centrifuged at 3000 x g for 10 min, and the resulting supernatant was used as template DNA in a multiplex PCR to identify the genes encoding the alpha, beta, epsilon and iota toxins and enterotoxin [16].…”

“…For each plate, up to three characteristic colonies containing sulfite-reducing microorganisms were suspended in 400 μL of ultrapure water (Milli-Q®) in Eppendorf tubes (2 ml) and subjected to thermal DNA extraction at 98 °C for 20 min in a thermoblock (HDV, BR) [15,16]. Subsequently, the microtubes were centrifuged at 3000 x g for 10 min, and the resulting supernatant was used as template DNA in a multiplex PCR to identify the genes encoding the alpha, beta, epsilon and iota toxins and enterotoxin [16]. For all the PCRs, the amplifications were performed in a thermocycler (Thermal Cycler Px2, Thermo Electron Corporation, USA), and the bands were visualized with ultraviolet light on a 2% agarose gel stained with ethidium bromide (Sigma-Aldrich Corporation, USA) [15,16].…”

“…Subsequently, the microtubes were centrifuged at 3000 x g for 10 min, and the resulting supernatant was used as template DNA in a multiplex PCR to identify the genes encoding the alpha, beta, epsilon and iota toxins and enterotoxin [16]. For all the PCRs, the amplifications were performed in a thermocycler (Thermal Cycler Px2, Thermo Electron Corporation, USA), and the bands were visualized with ultraviolet light on a 2% agarose gel stained with ethidium bromide (Sigma-Aldrich Corporation, USA) [15,16].…”