Inokulan bakteri pemfiksasi nitrogen (N2) Azotobacter umumnya diproduksi pada media bebas N untuk mengoptimalkan fiksasi N2, padahal Azotobacter juga mensintesis eksopolisakarida (EPS) yang berperan sebagai amelioran tanah. Fiksasi nitrogen dihambat oleh N anorganik sedangkan produksi EPS memerlukan N anorganik. Dengan demikian diperlukan komposisi media yang mendukung produksi EPS tetapi tetap menjaga aktivitas fiksasi N2. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan komposisi media cair Azotobacter berbasis molase yang diperkaya dengan asam amino sisteina dan serina untuk menghasilkan sel, EPS, dan N tersedia dengan konsentrasi yang sama dengan media anorganik. Optimasi media dilakukan pada fermentor 2 L pada suhu kamar dengan pengadukan 115 rpm selama 7 hari, kemudian inokulan cair disimpan selama dua bulan pada suhu kamar. Hasil penelitian menjelaskan bahwa pada hari ke-7, media molase 1% + NH4Cl 0,05% dengan maupun tanpa asam amino menurunkan populasi bakteri dibandingkan dengan media anorganik. Namun produksi EPS di media molase dengan asam amino menyamai kadar EPS di media anorganik. Setelah dua bulan penyimpanan media cair berbasis molase dengan penambahan sisteina 0,25% dan serina 0,1% meningkatkan populasi sel, serta kadar EPS dan N dibandingkan media anorganik, serta mempertahankan pH netral. Percobaan ini menjelaskan bahwa molase dengan NH4Cl yang diperkaya sisteina dan serina dapat digunakan untuk mengganti media anorganik untuk produksi EPS oleh Azotobacter.