Цель. Изучение изменений в образцах злокачественных опухолей молочной железы статуса метилирования остатков цитозина в составе CpG-островков, моноаллельно метилированных в норме. Методы. Для определения CpG-динуклеотидов, моноаллельно метилированных в опухолевых и нормальных тканях молочной железы, использовали полученные авторами ранее результаты широкогеномного бисульфитного секвенирования Xmal-RRBS. Изменения моноаллельного метилирования в опухолях визуализировали с помощью гистограмм для различных метилотипов молочной железы. Результаты. В геномах умеренно метилированных опухолей нормально моноаллельно метилированные CpG-динуклеотиды имеют тенденцию к почти равновероятному изменению как в неметилированное, так и в полностью метилированное состояния. В геномах гиперметилированных опухолей нормально моноаллельно метилированные CpG-динуклеотиды чаще меняют своё состояние на полностью метилированное. Заключение. Наблюдаемый характер изменений позволяет предположить, что динамика диктуется в умеренно метилированных опухолях процессами, не определяющими её вектор, а в гиперметилированных - дополнительно - направленным процессом, повышающим уровень метилирования CpG-динуклеотидов. По аналогии с ранее опубликованными результатами исследования динамики изменений метилирования импринтированных локусов в опухолях человека, мы предполагаем, что процесс случайного определения вектора изменения характера метилирования опосредован нарушениями копийности участков моноаллельного метилирования ДНК. Причиной равновероятных разнонаправленных изменений моноаллельного метилирования может быть геномный дисбаланс, который может случайным образом приводить к делециям (или приобретенной однородительской дисомии) либо метилированного, либо неметилированного аллеля. Aim: to evaluate changes in the methylation status of cytosine residues in CpG islands, monoallelically methylated in the norm, in samples of malignant breast tumors. Methods. To determine CpG dinucleotides monoallelically methylated in tumor and normal breast tissues, we used the results of Xmal-RRBS genome-wide bisulfite sequencing obtained earlier. Changes in monoallelic methylation in tumors were visualized using histograms for different breast methylotypes. Results. In the genomes of moderately methylated tumors, normally methylated CpG dinucleotides have a tendency to an almost equiprobable methylation change to both the unmethylated and fully methylated states. In the genomes of hypermethylated tumors, normally monoallelically methylated CpG dinucleotides more often change their state to fully methylated. Conclusions. The observed nature of the changes suggests that the dynamics is dictated in moderately methylated tumors by processes that do not determine their vector, and in hypermethylated tumors, additionally, by a directed process that increases the methylation level of CpG dinucleotides. By analogy with the previously published results of a study of the dynamics of changes in methylation of imprinted loci in human tumors, we assume that the process of random determination of the vector of methylation changes is mediated by copy number aberrations at the regions of monoallelic DNA methylation. The reason for the equally probable bidirectional changes in monoallelic methylation may be a genomic imbalance that can randomly lead to deletions (or acquired uniparental disomy) of either the methylated or unmethylated allele.
Введение. Метод метилчувствительной количественной ПЦР (МЧ-кПЦР) в режиме реального времени впервые описан в настоящей работе в многолокусном формате с использованием TaqMan-зондов. Многолокусный формат реакции облегчает тестирование больших выборок пациентов и способствует бережному расходованию коллекционных образцов биологического материала, а также позволяет включать в состав тест-систем необходимые контроли, обеспечивающие оценку полноты гидролиза матрицы и эффективности ПЦР. Цель: разработать тест-систему многолокусной МЧ-кПЦР для количественного анализа уровня метилирования ДНК и охарактеризовать её аналитические свойства. Методы. Материалом исследования служили смеси ДНК с заданным уровнем метилирования (препаратов ДНК, гидролизованных и негидролизованных метилчувствительной рестриктазой). Считали, что ДНК, необработанная метилчувствительной рестриктазой BstHHI, является модельной метилированной матрицей, в то время как гидролизованная ДНК - модельной неметилированной матрицей. МЧ-кПЦР проводили для двух целевых локусов - участков CpG-островков генов PRKCB и GMDS с включением положительного внутреннего контроля эффективности ПЦР и контроля полноты гидролиза геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой рестрикции. Для кинетических кривых исследуемых локусов с помощью пакета qpcR языка программирования R во всех образцах получены значения Cy0, и на основе этих данных рассчитали уровни метилирования модельных препаратов с заданными уровнями метилирования. Аналитическую чувствительность метода определяли путем нахождения значений Limit of Blank (LoB, измеряемое значение при отсутствии метилирования) и Limit of Detection (LoD, наименьший измеряемый уровень метилирования). Результаты. Определены аналитические свойства метода МЧ-кПЦР: аналитическая чувствительность составила 5%; относительная погрешность составила 11,38%; коэффициент детерминации (R2) для локусов PRKCB и GMDS составил 0,98 и 0,77, соответственно. Результаты измерений по локусу GMDS позволили предположить его моноаллельное метилирование в нормальных лимфоцитах крови, что было подтверждено анализом баз данных метилома человека. Исходя из полученных результатов, аналитическая чувствительность метода МЧ-кПЦР выше таковой метода прямого бисульфитного секвенирования по Сэнгеру и не уступает методу бисульфитного пиросеквенирования. Background. The method of multiplex methylation sensitive quantitative real-time PCR (MS-qPCR) is used for the first time in the format of a multiplex system with TaqMan probes. The previously described approaches to MSRE-qPCR are insufficient for the implementation of the technique in studies of large samples of patients, which is due to the lack of a multiplex reaction format and internal controls. We propose an MS-qPCR method with the possibility of multiplexing and the presence of internal PCR controls. Aim: to characterize the analytical properties of the developed multiplex MS-qPCR method. Methods. DNA from lymphocytes from healthy donors was used as a material for the study. We have postulated that DNA undigested with methylation sensitive restriction enzyme is a model methylated template (undigested), while hydrolyzed DNA is a model unmethylated template. To determine the analytical sensitivity, mixtures of digested and undigested DNA were used. Development of the MS-qPCR panel was carried out taking into account the design requirements developed by the team: the inclusion of a positive internal control of the PCR efficiency and a control of digestion of genomic DNA by the methylation sensitive restriction enzyme. For the kinetic curves of the studied loci in all samples, Cy0 values were obtained using the qPCR package of the R programming language, and on the basis of these data, methylation levels were calculated, and box plots were presented. The analytical sensitivity of the method was determined by finding the Limit of Blank (LoB) and Limit of Detection (LoD) values. Results. The coefficient of determination (R2) for the normally non-methylated locus is 0.98, and for the locus with normal monoallelic methylation, 0.77. Analytical sensitivity of the MS-qPCR method is 5%; the relative error was 11.38%. Conclusions. Based on the results obtained, the analytical sensitivity of the MS-qPCR method is higher than that of the direct Sanger bisulfite sequencing, and comparable to bisulfite pyrosequencing. The use of TaqMan probes allows multiplexing of several target loci in one reaction, which is a fine solution to the problem of a small amount of available biological material.
Синдром Сотоса представляет собой редкое аутосомно-доминантное заболевание с частотой встречаемости около 1:14000 новорожденных. Несмотря на ряд характерных клинических проявлений, его диагностика затруднена в связи с высокой степенью перекрывания фенотипа с рядом других наследственных синдромов, таких как синдром Видемана-Беквита или синдром Марфана. Молекулярно-генетической причиной синдрома Сотоса являются мутации в гене NSD1, приводящие к дисфункции белка. В статье представлены и охарактеризованы варианты в гене NSD1, найденные в ходе диагностики методами высокопроизводительного параллельного секвенирования (NGS) и MLPA. Sotos syndrome is a rare autosomal dominant disorder with an incidence of about 1 in 14,000 newborns. Despite a number of characteristic clinical manifestations, its diagnosis is difficult due to the high degree of overlap of the phenotype with a number of other hereditary syndromes, such as Beckwith-Wiedemann syndrome or Marfan syndrome. The molecular genetic cause of Sotos syndrome is mutations in the NSD1 gene, leading to protein dysfunction. The article presents and characterizes variants in the NSD1 gene found during diagnostics using high-throughput sequencing (NGS) and MLPA.
scite is a Brooklyn-based organization that helps researchers better discover and understand research articles through Smart Citations–citations that display the context of the citation and describe whether the article provides supporting or contrasting evidence. scite is used by students and researchers from around the world and is funded in part by the National Science Foundation and the National Institute on Drug Abuse of the National Institutes of Health.
hi@scite.ai
10624 S. Eastern Ave., Ste. A-614
Henderson, NV 89052, USA
Copyright © 2024 scite LLC. All rights reserved.
Made with 💙 for researchers
Part of the Research Solutions Family.