Vancomycin is an important nosocomial antibiotic containing a glycosylated, cross-linked and doubly chlorinated heptapeptide backbone. During the biosynthesis of the vancomycin aglycone, two β-hydroxytyrosine (Bht) residues are inserted at positions-2 and -6 into the heptapeptide backbone by a non-ribosomal peptide synthetase. A single flavin-dependent chlorinase (VhaA) is responsible for chlorinating both Bht residues at some ill-defined point in the assembly process. We show here using in vitro assays that VhaA is able to introduce a chlorine atom into each aromatic ring of both Bht residues at positions-2 and -6 of a peptide carrier protein-bound hexapeptide. The results suggest that VhaA can recognize and chlorinate two quite different sites within a linear hexapeptide intermediate during vancomycin biosynthesis.

No abstract

Oxidative Phenol-Kupplungen, welche durch bestimmte Cytochrom-P450-Enzyme katalysiert werden, spielen in der Biosynthese der Glykopeptid-Antibiotika Vancomycin und Balhimycin eine wichtige Rolle. Für die Biosynthese des gemeinsamen Heptapeptid-Aglykons der beiden Antibiotika werden je ein Molekül (2S,3R)-und (2R,3R)-b-Hydroxytyrosin (Bht), zwei vom Tyrosin abgeleitete (R)-p-Hydroxyphenylglycine (Hpg), ein Polyketidderivat (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (Dpg), sowie die natürlichen Aminosäuren Leucin und Asparagin bençtigt (Abbildung 1). [1] Auffällige Merkmale des Aglykons sind die Biaryl-(A-B) und Biarylether-Verknüpfungen (C-O-D und D-O-E) , welche die kuppelfçrmige Struktur des Moleküls ausbilden. Desweiteren enthalten zwei der cyclisierten aromatischen Seitenketten Chlor-Substituenten. Molekulargenetische Studien der Balhimycin-Biosynthese haben gezeigt, dass das Heptapeptid-Rückgrat durch nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) zusammengebaut wird, wohingegen die Ringschlüsse in der Reihenfolge C-O-D, D-O-E und schließlich A-B durch die P450-Enzyme OxyB, OxyA und OxyC erfolgen. [2] Zwei Chlorierungen werden durch eine einzige Flavin-abhängige Halogenase katalysiert. [3] Die genauen Zeitpunkte der Phenol-Kupplungs-sowie der Chlorierungsschritte während der Biosynthese des Vancomycin/Balhimycin-Rückgrats sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Frühere In-vitro-Studien mit Hexapeptid-und Heptapeptid-Modellsubstraten, welche Tyr-Reste an den Positionen 2 und 6 enthalten, haben gezeigt, dass OxyB eine Kupplung zwischen den aromatischen Ringen von Hpg4 und Tyr6 katalysieren kann, wenn das Modellpeptid als C-terminaler Thioester an eine isolierte Peptid-Träger-Protein-Domäne (PCP) aus der Vancomycin-NRPS gebunden ist (Abbildung 1). [4] Um Substrate zu erzeugen, die den zu erwartenden biosynthetischen Intermediaten strukturell noch ähnlicher sind, haben wir uns hier vorgenommen, die Tyr2/Tyr6-Reste in den Modellpeptiden mit Bht und/oder meta-Chlor-b-hydroxytyrosin (Cht) zu ersetzen, in der Erwartung, dass das Vorhandensein von b-Hydroxy-und/oder Chlor-Substituenten die Peptide zu besseren Substraten für OxyB machen kçnnte. Das Gegenteil ist aber der Fall: Wir berichten hier, dass die Einführung von Chlor-Substituenten in einem Hexapeptid-S-PCP die Geschwindigkeit des Ringschlusses durch OxyB drastisch senkt (> 20 mal geringer als beim nichtchlorierten Modellsubstrat), und dass ein Heptapeptid-S-PCP mit einem chlorierten Rest 6 von OxyB nicht mehr als Substrat erkannt und somit nicht in das cyclisierte Produkt umgesetztAbbildung 1. Schlüsselschritte im Aufbau des Rückgrats während der Vancomycin-und Balhimycin-Biosynthese (Vancomycin und Balhimycin haben das gleiche Aglykon). Gezeigt ist die zu erwartende Organisation der Domänen von Modul-6 und -7, in der Vancomycin NRPS-Untereinheit-2 (VpsB) und -3 (VpsC) (C = Kondensationsdomäne, A = Adenylierungsdomäne, PCP = Peptid-Träger-Protein-Domäne, TE = Thioesterase-Domäne, X = Domäne mit unbekannter Funktion). Das gezeigte Hexapeptid-S-PCP-Thioester-Intermediat sollte dur...