Studien zur Aktivität des P450‐Enzymes OxyB in der Biosynthese von Vancomycin: Einfluss der Chlor‐ und Hydroxy‐Substituenten

Abstract

Oxidative Phenol-Kupplungen, welche durch bestimmte Cytochrom-P450-Enzyme katalysiert werden, spielen in der Biosynthese der Glykopeptid-Antibiotika Vancomycin und Balhimycin eine wichtige Rolle. Für die Biosynthese des gemeinsamen Heptapeptid-Aglykons der beiden Antibiotika werden je ein Molekül (2S,3R)-und (2R,3R)-b-Hydroxytyrosin (Bht), zwei vom Tyrosin abgeleitete (R)-p-Hydroxyphenylglycine (Hpg), ein Polyketidderivat (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (Dpg), sowie die natürlichen Aminosäuren Leucin und Asparagin bençtigt (Abbildung 1). [1] Auffällige Merkmale des Aglykons sind die Biaryl-(A-B) und Biarylether-Verknüpfungen (C-O-D und D-O-E) , welche die kuppelfçrmige Struktur des Moleküls ausbilden. Desweiteren enthalten zwei der cyclisierten aromatischen Seitenketten Chlor-Substituenten. Molekulargenetische Studien der Balhimycin-Biosynthese haben gezeigt, dass das Heptapeptid-Rückgrat durch nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) zusammengebaut wird, wohingegen die Ringschlüsse in der Reihenfolge C-O-D, D-O-E und schließlich A-B durch die P450-Enzyme OxyB, OxyA und OxyC erfolgen. [2] Zwei Chlorierungen werden durch eine einzige Flavin-abhängige Halogenase katalysiert. [3] Die genauen Zeitpunkte der Phenol-Kupplungs-sowie der Chlorierungsschritte während der Biosynthese des Vancomycin/Balhimycin-Rückgrats sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Frühere In-vitro-Studien mit Hexapeptid-und Heptapeptid-Modellsubstraten, welche Tyr-Reste an den Positionen 2 und 6 enthalten, haben gezeigt, dass OxyB eine Kupplung zwischen den aromatischen Ringen von Hpg4 und Tyr6 katalysieren kann, wenn das Modellpeptid als C-terminaler Thioester an eine isolierte Peptid-Träger-Protein-Domäne (PCP) aus der Vancomycin-NRPS gebunden ist (Abbildung 1). [4] Um Substrate zu erzeugen, die den zu erwartenden biosynthetischen Intermediaten strukturell noch ähnlicher sind, haben wir uns hier vorgenommen, die Tyr2/Tyr6-Reste in den Modellpeptiden mit Bht und/oder meta-Chlor-b-hydroxytyrosin (Cht) zu ersetzen, in der Erwartung, dass das Vorhandensein von b-Hydroxy-und/oder Chlor-Substituenten die Peptide zu besseren Substraten für OxyB machen kçnnte. Das Gegenteil ist aber der Fall: Wir berichten hier, dass die Einführung von Chlor-Substituenten in einem Hexapeptid-S-PCP die Geschwindigkeit des Ringschlusses durch OxyB drastisch senkt (> 20 mal geringer als beim nichtchlorierten Modellsubstrat), und dass ein Heptapeptid-S-PCP mit einem chlorierten Rest 6 von OxyB nicht mehr als Substrat erkannt und somit nicht in das cyclisierte Produkt umgesetztAbbildung 1. Schlüsselschritte im Aufbau des Rückgrats während der Vancomycin-und Balhimycin-Biosynthese (Vancomycin und Balhimycin haben das gleiche Aglykon). Gezeigt ist die zu erwartende Organisation der Domänen von Modul-6 und -7, in der Vancomycin NRPS-Untereinheit-2 (VpsB) und -3 (VpsC) (C = Kondensationsdomäne, A = Adenylierungsdomäne, PCP = Peptid-Träger-Protein-Domäne, TE = Thioesterase-Domäne, X = Domäne mit unbekannter Funktion). Das gezeigte Hexapeptid-S-PCP-Thioester-Intermediat sollte dur...

The Biocatalytic Repertoire of Natural Biaryl Formation

“…Nonpolar deletion mutants of OxyABC from the balhimycin gene cluster produced linear, non-chlorinated peptides (DoxyB) and monocyclic or bicyclic, fully chlorinated peptides (DoxyA and DoxyC, respectively). [34b] This, together with the significantly lower turnover of chlorinated hexa-and heptapeptides by vancomycin OxyB in vivo, [37] raises the question of whether fully chlorinated, linear peptides found in earlier knockout studies [31b, 35a] are mere shunt products. In this case, it is possible that halogenation occurs after the initial coupling by OxyB, [37] thereby making the halogenation reaction the stereochemically decisive step.…”

Torands Revisited: Metal Sequestration and Self‐Assembly of Cyclo‐2,9‐tris‐1,10‐phenanthroline Hexaaza Macrocycles

“…Nichtpolare Deletionsmutanten von OxyABC des Balhimycin‐Clusters produzierten lineare, nichtchlorierte Peptide (Δ oxyB ) und monocyclische oder bicyclische, vollständig chlorierte Peptide (Δ oxyA oder Δ oxyC ) 34b. Zusammen mit einer signifikant geringen Umsetzung von chlorierten Hexa‐ und Heptapeptiden durch Vancomycin‐OxyB in vivo37 wirft dies die Frage auf, ob es sich bei den in früheren Deletionsstudien entdeckten, vollständig chlorierten linearen Peptiden31b, 35a lediglich um Nebenprodukte des Biosyntheseweges handelt. In diesem Fall wäre es möglich, dass die Halogenierung erst nach der initialen Kupplung durch OxyB erfolgt,37 wodurch die Halogenierungsreaktion zum stereochemisch entscheidenden Schritt würde.…”