Modified nucleotides impact all aspects of eukaryotic mRNAs and contribute to regulation of gene expression at the transcriptional and translational level. At the 5' cap, adenosine as first transcribed nucleotide is often N 6 -methyl-2'-O-methyl adenosine (m 6 A m ). This modification is tissue dependent and reversible, pointing to a regulatory function. CAPAM was recently identified as methyltransferase responsible for m 6 A m formation, however, the direct assignment of its target transcripts proves difficult. Antibodies do not discriminate between internal N 6 -methyl adenosine (m 6 A) and m 6 A m . Here we present CAPturAM, an antibody-free chemical biology approach for direct enrichment and probing of physiological CAPAM-targets. We harness CAPAM's cosubstrate promiscuity to install propargyl groups on its targets. Subsequent functionalization with an affinity handle allows for their enrichment. Using wildtype and CAPAM À /À cells, we successfully applied CAPturAM to confirm or disprove CAPAM-targets, facilitating the verification and identification of CAPAM targets.
Modifizierte Nukleotide beeinflussen eukaryontische mRNAs in allen Bereichen ihres Lebenszyklus und tragen zur Regulierung der Genexpression auf Transkriptions-und Translationsebene bei. An der 5'-Kappe kommt Adenosin als erstes transkribiertes Nukleotid häufig als N 6 -Methyl-2'-O-methyladenosin (m 6 A m ) vor. Dieser Modifikationstyp tritt gewebespezifisch und reversibel auf, was auf eine regulatorische Funktion hindeutet. CAPAM wurde als Methyltransferase identifiziert, die für die Bildung von m 6 A m verantwortlich ist, doch erweist sich die direkte Identifizierung ihrer Zieltranskripte als schwierig, da Antikörper nicht zwischen internem N 6 -Methyladenosin (m 6 A) und m 6 A m unterscheiden können. Hier stellen wir CAPturAM vor, einen antikörperfreien chemisch-biologischen Ansatz zur direkten Anreicherung und Detektion physiologischer CAPAM-Targets. Wir nutzen die Promiskuität von CAPAM aus, um Propargylgruppen gezielt an seine Targets zu transferieren. Die anschließende Funktionalisierung ermöglicht die Anreicherung dieser Target-RNAs. Unter Verwendung von Wildtyp-und CAPAM À /À -Zellen wurde CAPturAM erfolgreich eingesetzt, um CAPAM-Targets zu bestätigen oder zu widerlegen, was die gegenwärtige Überprüfung und Identifizierung von CAPAM-Targets erleichtert.[ + ] Diese Autoren haben zu gleichen Teilen zu der Arbeit beigetragen.
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