CAPturAM, eine chemo‐enzymatische Strategie zur selektiven Detektion von physiologischen CAPAM‐Targets

Abstract

Modifizierte Nukleotide beeinflussen eukaryontische mRNAs in allen Bereichen ihres Lebenszyklus und tragen zur Regulierung der Genexpression auf Transkriptions-und Translationsebene bei. An der 5'-Kappe kommt Adenosin als erstes transkribiertes Nukleotid häufig als N 6 -Methyl-2'-O-methyladenosin (m 6 A m ) vor. Dieser Modifikationstyp tritt gewebespezifisch und reversibel auf, was auf eine regulatorische Funktion hindeutet. CAPAM wurde als Methyltransferase identifiziert, die für die Bildung von m 6 A m verantwortlich ist, doch erweist sich die direkte Identifizierung ihrer Zieltranskripte als schwierig, da Antikörper nicht zwischen internem N 6 -Methyladenosin (m 6 A) und m 6 A m unterscheiden können. Hier stellen wir CAPturAM vor, einen antikörperfreien chemisch-biologischen Ansatz zur direkten Anreicherung und Detektion physiologischer CAPAM-Targets. Wir nutzen die Promiskuität von CAPAM aus, um Propargylgruppen gezielt an seine Targets zu transferieren. Die anschließende Funktionalisierung ermöglicht die Anreicherung dieser Target-RNAs. Unter Verwendung von Wildtyp-und CAPAM À /À -Zellen wurde CAPturAM erfolgreich eingesetzt, um CAPAM-Targets zu bestätigen oder zu widerlegen, was die gegenwärtige Überprüfung und Identifizierung von CAPAM-Targets erleichtert.[ + ] Diese Autoren haben zu gleichen Teilen zu der Arbeit beigetragen.