Proper telomeric chromatin configuration is thought to be essential for telomere homeostasis and stability. Previous studies in mouse suggested that loss of heterochromatin marks at telomeres might favor onset of Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) pathway, by promoting homologous recombination. However, analysis of chromatin status at human ALT telomeres has never been reported. Here, using isogenic human cell lines and cellular hybrids, which rely either on telomerase or ALT to maintain telomeres, we show that chromatin compaction is reduced at ALT telomeres and this is associated with a global decrease in telomeric H3K9me3. This, subsequently, leads to upregulation of telomere transcription. Accordingly, restoration of a more condensed telomeric chromatin through telomerase-dependent elongation of short ALT telomeres reduces telomere transcription. We further show that loss of ATRX chromatin remodeler function, a frequent characteristic of ALT cells, is not sufficient to decrease chromatin condensation at telomeres nor to increase the expression of telomeric RNA species. These results offer new insight on telomeric chromatin properties in ALT cells and support the hypothesis that telomeric chromatin decondensation is important for ALT pathway.

The AMPK/PGC-1α metabolic pathway and nuclear respiratory factor 1 up-regulate human telomere transcription.

Highlights d TSPYL5 is a telomere-associated protein crucial for the survival of ALT + cells only d TSPYL5 protects POT1 from poly-ubiquitination and degradation in ALT + cells d TSPYL5-depleted ALT + cells require USP7 deubiquitinase for POT1 poly-ubiquitination d ALT telomere association with PML bodies sensitizes POT1 to poly-ubiquitination

PARN, poly(A)‐specific ribonuclease, regulates the turnover of mRNAs and the maturation and stabilization of the h TR RNA component of telomerase. Biallelic PARN mutations were associated with Høyeraal–Hreidarsson (HH) syndrome, a rare telomere biology disorder that, because of its severity, is likely not exclusively due to h TR down‐regulation. Whether PARN deficiency was affecting the expression of telomere‐related genes was still unclear. Using cells from two unrelated HH individuals carrying novel PARN mutations and a human PARN knock‐out (KO) cell line with inducible PARN complementation, we found that PARN deficiency affects both telomere length and stability and down‐regulates the expression of TRF1 , TRF2 , TPP1 , RAP1 , and POT1 shelterin transcripts. Down‐regulation of dyskerin‐encoding DKC1 mRNA was also observed and found to result from p53 activation in PARN‐deficient cells. We further showed that PARN deficiency compromises ribosomal RNA biogenesis in patients' fibroblasts and cells from heterozygous Parn KO mice. Homozygous Parn KO however resulted in early embryonic lethality that was not overcome by p53 KO. Our results refine our knowledge on the pleiotropic cellular consequences of PARN deficiency.

cMutations in ATRX (alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked), a chromatin-remodeling protein, are associated with the telomerase-independent ALT (alternative lengthening of telomeres) pathway of telomere maintenance in several types of cancer, including human gliomas. In telomerase-positive glioma cells, we found by immunofluorescence that ATRX localized not far from the chromosome ends but not exactly at the telomere termini. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments confirmed a subtelomeric localization for ATRX, yet short hairpin RNA (shRNA)-mediated genetic inactivation of ATRX failed to trigger the ALT pathway. Cohesin has been recently shown to be part of telomeric chromatin. Here, using ChIP, we showed that genetic inactivation of ATRX provoked diminution in the amount of cohesin in subtelomeric regions of telomerasepositive glioma cells. Inactivation of ATRX also led to diminution in the amount of TERRAs, noncoding RNAs resulting from transcription of telomeric DNA, as well as to a decrease in RNA polymerase II (RNAP II) levels at the telomeres. Our data suggest that ATRX might establish functional interactions with cohesin on telomeric chromatin in order to control TERRA levels and that one or the other or both of these events might be relevant to the triggering of the ALT pathway in cancer cells that exhibit genetic inactivation of ATRX.T he linear chromosomes of eukaryotic organisms require particular protection at their extremities. Telomeres, which represent the ends of these chromosomes and contain repeated TGrich sequences that do not code for proteins, as well as proteins of the shelterin complex, are essential for this protection (1). Telomeres protect chromosome ends from DNA repair activities that reseal chromosome internal DNA breaks occurring during DNA damage (2). Telomere sequences naturally erode with ongoing cell divisions, due to intrinsic mechanisms associated with the fixed 5=-to-3= polarity of replication of the DNA of the genome. Below a certain threshold, shortened telomeres result in DNA damageinduced cell cycle arrest, which is the equivalent of replicative senescence in cultured cells.By limiting the replicative potential of cells, telomere length acts as a biological clock, and telomere erosion serves as a barrier against tumorigenesis in healthy tissue. Paradoxically, telomere erosion or telomere dysfunction also induces chromosomal instability and favors the emergence of tumors (3). However, following cancer initiation, tumor cells must overcome the telomere-controlled replicative-senescence barrier, and all have an absolute necessity to maintain functional telomeres in order to sustain continuous and unlimited cell proliferation. In around 85 to 90% of cancer types, this occurs through upregulation of telomerase, a reverse transcriptase with a built-in RNA template specialized in telomeric DNA replication that is naturally repressed in most somatic tissues (4). In the remaining 10 to 15% of cancer types, an alternative pathway called the ALT (alternativ...

Novel dinuclear ruthenium(ii) complexes were designed to target and to photo-react with G-quadruplex telomeric DNA. Thanks to a microscopic-based telomere dysfunction assay, we brought the first evidence of G-driven telomeric DNA photo-lesions in cellulo.

Some tumors acquire replicative immortality by activating an ALTernative telomerase-independent telomere maintenance mechanism. ALT offers interesting therapeutic perspectives but lacks any known specific targets. We discovered a crucial role for TSPYL5 (Testis-Specific Y-encoded-Like Protein 5) in keeping ALT cell viability by protecting POT1 (Protection Of Telomeres 1) from proteasomal degradation.

Η έγκριση διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Νόμος 5543/1932, άρθρο 202, παράγραφος 2) v ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΕΛΙΔΑ ΤΙΤΛΟΥ i ΟΡΚΟΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΡΑΤΗ iii ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ iv ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ v ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ x Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 1.0 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.2.7.1 Θεραπεία πρώτης γραμμής (Πρωτογενής θεραπεία) 1.2.7.1.1 Χορήγηση υψηλής δόσης μελφαλάνης σε συνδυασμό με αυτόλογη μεταμόσχευση στελεχιαίων κυττάρων 1.2.7.1.2 Συμβατική θεραπεία με τη χορήγηση αποκλειστικά χημειοθεραπευτικών σχημάτων 1.2.7.2 Υποστηρικτική θεραπεία 1.2.8 Μελφαλάνη 1.3 Μέτρηση της DNA βλάβης με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction-PCR) 1.3.1 Γενικά 1.3.2 Μέθοδοι μέτρησης της ταχύτητας σχηματισμού/επιδιόρθωσης της DNA βλάβης σε επίπεδο γονιδίου 1.3.3 Αρχή λειτουργίας της μεθόδου της ποσοτικής PCR για την ποσοτικοποίηση της DNA βλάβης 1.3.4 Πλεονεκτήματα της ποσοτικής PCR έναντι της ανάλυσης κατά Southern στην μέτρηση της DNA βλάβης 1.3.5 Περιορισμοί-Μειονεκτήματα της ποσοτικής PCR στην μέτρηση της DNA βλάβης. Βελτίωση της μεθόδου 1.3.6 Πολλαπλή PCR ΙΙ. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.0 ΣΚΕΠΤΙΚΟ ΚΑΙ ΣΚΟΠΟΣ 2.0 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Αποστείρωση 2.2 Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας 2.3 Χαρακτηριστικά ασθενών 2.4 Συνθήκες χορήγησης μελφαλάνης 2.4.1 Χορήγηση μελφαλάνης σε ανθρώπινους ινοβλάστες 2.4.2 Χορήγηση μελφαλάνης σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος υγιών ατόμων και ασθενών με Πολλαπλούν Μυέλωμα. vii 2.4.3 Χορήγηση μελφαλάνης στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2 (κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος) 2.5 Μέθοδοι μέτρησης της κυτταροτοξικότητας 2.5.1 Προσδιορισμός του κυτταρικού πολλαπλασιασμού 2.5.2 Καθορισμός κυτταρικής βιωσιμότητας με χρώση trypan blue 2.6 Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος από συνολικό αίμα 2.7 Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων από εκχυλίσματα ανθρώπινων κυττάρων 2.7.1 Απομόνωση γενωμικού DNA από ανθρώπινους ινοβλάστες, καρκινικά κύτταρα HepG2 και απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος 2.7.2 Απομόνωση συνολικού RNA από ανθρώπινους ινοβλάστες και απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος με TRIzol 2.8 Μέτρηση των βλαβών της μελφαλάνης με ανάλυση κατά Southern 2.9 Ραδιενεργός σήμανση μορίων-ανιχνευτών DNA 2.10 Προσδιορισμός του σχετικού βαθμού συμπύκνωσης της τοπικής δομής της χρωματίνης συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος 2.11 Μέτρηση των επιπέδων μεταγραφικής ενεργότητας των τεσσάρων γονιδίων 2.11.1 Δοκιμασία σχισμής για RNA (RNA slot blot analysis) 2.11.2 Μέτρηση του ρυθμού μεταγραφής των γονιδίων σε απομονωμένους πυρήνες ινοβλαστών (run off transcription analysis) 2.12 Μέτρηση συνολικής RNA σύνθεσης 2.13 Μέτρηση συνολικής επιδιόρθωσης του κυττάρου 2.14 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης -PCR 2.14.1 Γενικές αρχές της PCR 2.14.2 Αντιδραστήρια και συνθήκες της ποσοτικής PCR για την ποσοτικοποίηση των βλαβών της μελφαλάνης. 2.14.3 Ποσοτικοποίηση των βλαβών 3.0 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ viii 3.1 Μελέτη του μοριακού μηχανισμού επιδιόρθωσης των βλαβών που προκαλούνται στο DNA από την επίδραση τ...