Μελέτη Μοριακών Μηχανισμών Απόκρισης Του Κυττάρου Στις Βλάβες Του DNA Που Επάγονται Από Αλκυλιωτικούς Παράγοντες

Abstract

Η έγκριση διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Νόμος 5543/1932, άρθρο 202, παράγραφος 2) v ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΕΛΙΔΑ ΤΙΤΛΟΥ i ΟΡΚΟΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΡΑΤΗ iii ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ iv ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ v ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ x Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 1.0 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.2.7.1 Θεραπεία πρώτης γραμμής (Πρωτογενής θεραπεία) 1.2.7.1.1 Χορήγηση υψηλής δόσης μελφαλάνης σε συνδυασμό με αυτόλογη μεταμόσχευση στελεχιαίων κυττάρων 1.2.7.1.2 Συμβατική θεραπεία με τη χορήγηση αποκλειστικά χημειοθεραπευτικών σχημάτων 1.2.7.2 Υποστηρικτική θεραπεία 1.2.8 Μελφαλάνη 1.3 Μέτρηση της DNA βλάβης με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction-PCR) 1.3.1 Γενικά 1.3.2 Μέθοδοι μέτρησης της ταχύτητας σχηματισμού/επιδιόρθωσης της DNA βλάβης σε επίπεδο γονιδίου 1.3.3 Αρχή λειτουργίας της μεθόδου της ποσοτικής PCR για την ποσοτικοποίηση της DNA βλάβης 1.3.4 Πλεονεκτήματα της ποσοτικής PCR έναντι της ανάλυσης κατά Southern στην μέτρηση της DNA βλάβης 1.3.5 Περιορισμοί-Μειονεκτήματα της ποσοτικής PCR στην μέτρηση της DNA βλάβης. Βελτίωση της μεθόδου 1.3.6 Πολλαπλή PCR ΙΙ. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.0 ΣΚΕΠΤΙΚΟ ΚΑΙ ΣΚΟΠΟΣ 2.0 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Αποστείρωση 2.2 Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας 2.3 Χαρακτηριστικά ασθενών 2.4 Συνθήκες χορήγησης μελφαλάνης 2.4.1 Χορήγηση μελφαλάνης σε ανθρώπινους ινοβλάστες 2.4.2 Χορήγηση μελφαλάνης σε απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος υγιών ατόμων και ασθενών με Πολλαπλούν Μυέλωμα. vii 2.4.3 Χορήγηση μελφαλάνης στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά HepG2 (κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος) 2.5 Μέθοδοι μέτρησης της κυτταροτοξικότητας 2.5.1 Προσδιορισμός του κυτταρικού πολλαπλασιασμού 2.5.2 Καθορισμός κυτταρικής βιωσιμότητας με χρώση trypan blue 2.6 Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος από συνολικό αίμα 2.7 Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων από εκχυλίσματα ανθρώπινων κυττάρων 2.7.1 Απομόνωση γενωμικού DNA από ανθρώπινους ινοβλάστες, καρκινικά κύτταρα HepG2 και απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος 2.7.2 Απομόνωση συνολικού RNA από ανθρώπινους ινοβλάστες και απομονωμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος με TRIzol 2.8 Μέτρηση των βλαβών της μελφαλάνης με ανάλυση κατά Southern 2.9 Ραδιενεργός σήμανση μορίων-ανιχνευτών DNA 2.10 Προσδιορισμός του σχετικού βαθμού συμπύκνωσης της τοπικής δομής της χρωματίνης συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος 2.11 Μέτρηση των επιπέδων μεταγραφικής ενεργότητας των τεσσάρων γονιδίων 2.11.1 Δοκιμασία σχισμής για RNA (RNA slot blot analysis) 2.11.2 Μέτρηση του ρυθμού μεταγραφής των γονιδίων σε απομονωμένους πυρήνες ινοβλαστών (run off transcription analysis) 2.12 Μέτρηση συνολικής RNA σύνθεσης 2.13 Μέτρηση συνολικής επιδιόρθωσης του κυττάρου 2.14 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης -PCR 2.14.1 Γενικές αρχές της PCR 2.14.2 Αντιδραστήρια και συνθήκες της ποσοτικής PCR για την ποσοτικοποίηση των βλαβών της μελφαλάνης. 2.14.3 Ποσοτικοποίηση των βλαβών 3.0 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ viii 3.1 Μελέτη του μοριακού μηχανισμού επιδιόρθωσης των βλαβών που προκαλούνται στο DNA από την επίδραση τ...