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In this work, the sources of contamination by Enterococcus spp. in a ricotta processing line were evaluated. The isolated strains were tested for virulence genes (gelE, cylA,B, M, esp, agg, ace, efaA, vanB), expression of virulence factors (hemolysin and gelatinase), and the resistance to 10 different antibiotics. Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis were subjected to discriminatory identification by intergenic spacer region (ITS)-polymerase chain reaction and sequencing of the ITS region. The results showed that Enterococcus spp. was detected in the raw materials, environment samples and the final product. None of the 107 Enterococcus isolates were completely free from all virulence genes considered. A fraction of 21.5% of the isolates containing all of the genes of the cylA, B, M operon also expressed β-hemolysis. Most of the isolates showed the gelE gene, but only 9.3% were able to hydrolyze gelatin. In addition, 23.5% of the observed Enterococcus isolates had the vanB gene but were susceptible to vancomycin in vitro. The dissemination of antibiotic-resistant enterococci was revealed in this study: 19.3% of the E. faecium samples and 78.0% of the E. faecalis samples were resistant to at least one of the antibiotics tested. Sequencing of region discriminated 5 and 7 distinct groups among E. faecalis and E. faecium, respectively. Although some similarity was observed among some of the isolates, all E. faecalis and E. faecium isolates had genetic differences both in the ITS region and in the virulence profile, which makes them different from each other.

RESUMO -A presença de Enterococcus spp. em alimentos representa um perigo para a saúde pública, devido a sua frequente associação a várias infecções clínicas. A patogenicidade de Enterococcus é multifatorial, complexa e ocorre a partir de uma sequência de fatores de virulência. O objetivo do estudo foi avaliar a presença de determinantes fenotípicos e genotípicos de virulência em Enterococcus spp. isolados de queijo de Coalho. Um total de 53 cepas de Enterococcus spp. foram analisadas quanto à susceptibilidade a antimicrobianos, produção de hemolisinas, DNAse, termonuclease, gelatinase e o perfil de genes codificadores de virulência. Observou-se que 75,5% das cepas foram resistentes a pelo menos um dos nove antibióticos testados, 26,42% foram resistentes a dois e 3,77% a três antibióticos. A presença de fenótipos de resistência à vancomicina foi constatada em 11,33% das cepas. A atividade hemolítica foi observada em 100% das cepas, a produção de DNAse, em apenas 3,8%, e não houve produção de termonuclease e gelatinase. As cepas resistentes à vancomicina e teicoplanina foram identificadas como E. faecium e Enterococcus spp. O perfil de determinantes genéticos de virulência foi bastante variável e 90% das cepas abrigavam pelo menos um dos nove genes pesquisados. O gene efaA apresentou maior prevalência (70%), seguido do gene ace (50%), gene esp e gene gelE (40%). Palavras-chaves: Produtos lácteos. Bactérias ácido láticas. Patogenicidade. Susceptibilidade a antibióticos.ABSTRACT -The presence of Enterococcus spp. in food poses a danger to public health due to its frequent association with various clinical infections. Pathogenicity in Enterococcus is multifactorial and complex, and stems from a sequence of virulence factors. The aim of this study was to evaluate the presence of phenotypic and genotypic determinants of virulence in Enterococcus spp. isolated from curd cheese. A total of 53 strains of Enterococcus spp. were analysed as to their susceptibility to antimicrobial agents, production of hemolysins, DNAse, thermonuclease, and gelatinase, and the profile of virulence-encoding genes. It was found that 75.5% of the strains were resistant to at least one of the nine antibiotics tested, 26.42% were resistant to two, and 3.77% to three antibiotics. The presence of vancomycin-resistance phenotypes was seen in 11.33% of the strains. Haemolytic activity was observed in 100% of strains and DNAse production in only 3.8%. There was no production of thermonuclease or gelatinase. Strains resistant to vancomycin and teicoplanin were identified as E. faecium and Enterococcus spp. The profile of the genetic determinants of virulence was highly variable, and 90% of the strains harboured at least one of the nine genes being studied. The efaA gene showed the highest prevalence (70%), followed by the ace gene (50%), the esp gene and gelE gene (40%).

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Neste trabalho avaliou-se a adequação de amostras de ricota provenientes de um laticínio localizado no sul de Minas Gerais aos padrões microbiológicos fixados pela RDC n°12/2001 da ANVISA, complementado pela avaliação da potabilidade da água de processo utilizada na indústria de laticínios. Foram realizadas análises microbiológicas de Salmonella sp., Listeria monocytogenes, coliformes a 45 °C e estafilococos coagulase positiva e negativa em 15 amostras de ricota. Complementarmente, um total de 3 amostras de água utilizada na planta de processo foi avaliado quanto à contagem de  coliformes totais, termotolerantes e bactérias heterotróficas. Os resultados revelaram que 13% (2/15) das amostras de ricota estavam em desacordo com os padrões para contagem de estafilococos coagulase positiva e 13 amostras (87%) apresentaram contagens de estafilococos coagulase negativa entre 5,9 x 104 e 4,9 x 106 UFC/g. Em nenhuma das amostras foi detectada a presença de Salmonella sp., L. monocytogenes e a contagem de coliformes termotolerantes foi <3 NMP/g. Das 3 amostras de água analisadas, 1 (33%) estava fora dos padrões de potabilidade preconizados pela legislação. Os resultados evidenciaram possíveis deficiências na aplicação das boas práticas de fabricação e, portanto, a consequente necessidade de medidas corretivas para o controle da inocuidade das ricotas produzidas.

AgradecimentosÀ minha mãe, Bernadete e ao meu pai Roberto, por todo carinho, conselhos, incentivo e por estarem presentes em todos os momentos importantes da minha vida.Às minhas irmãs Ju e Angel, por estarem sempre presentes nos momentos que precisei.Aos meus queridos e eternos mestres Célio e Marco, por acreditarem no meu potencial, pelos conselhos e por me incentivarem a seguir adiante.Ao meu orientador, Arnaldo, pela orientação, paciência, incentivo e conselhos em momentos oportunos.À minha co-orientadora, Fátima, pelo grande projeto e por todo o incentivo dado durante todo o desenvolvimento deste.À Dirce pela disposição em ajudar, por todos os ensinamentos, conselhos e incentivo.À Dra Juliane D. G. Carvalho e à Dra Celina M. Soares pelo apoio no desenvolvimento do projeto.Ao prof. Dr. Márcio José da Silva, do CBMEG, pelo incentivo, apoio e ensinamentos no sequenciamento.À Dani e Aline, também do CBMEG, pelo apoio no sequenciamento e ensinamentos.À Dra Maristela S. Nascimento pelas correções e sugestões para o desenvolvimento do projeto.Ao meu amigo Dãã, pela ajuda, conselhos e por ter me passado um pedacinho de todo o seu conhecimento, que foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho.À minha amiga e "irmãzinha" postiça Fabíola, pela amizade, carinho, incentivo e por sempre me ouvir nos momentos que mais precisei.Aos meus amigos de sempre Edivânia, Adriana e Thiago, pela imensa ajuda e grande incentivo.Aos meus amigos que fiz em Campinas: Cecília, Diogo, Eto, Evandro, Karina, Karol e Simone, pela amizade, apoio e pelos momentos de alegria e descontração.