The Dimerization Domain in DapE Enzymes Is required for Catalysis

Abstract

The emergence of antibiotic-resistant bacterial strains underscores the importance of identifying new drug targets and developing new antimicrobial compounds. Lysine and meso-diaminopimelic acid are essential for protein production and bacterial peptidoglycan cell wall remodeling and are synthesized in bacteria by enzymes encoded within dap operon. Therefore dap enzymes may serve as excellent targets for developing a new class of antimicrobial agents. The dapE-encoded N-succinyl-L,L-diaminopimelic acid desuccinylase (DapE) converts N-succinyl-L,L-diaminopimelic acid to L,L-diaminopimelic acid and succinate. The enzyme is composed of catalytic and dimerization domains, and belongs to the M20 peptidase family. To understand the specific role of each domain of the enzyme we engineered dimerization domain deletion mutants of DapEs from Haemophilus influenzae and Vibrio cholerae, and characterized these proteins structurally and biochemically. No activity was observed for all deletion mutants. Structural comparisons of wild-type, inactive monomeric DapE enzymes with other M20 peptidases suggest that the dimerization domain is essential for DapE enzymatic activity. Structural analysis and molecular dynamics simulations indicate that removal of the dimerization domain increased the flexibility of a conserved active site loop that may provide critical interactions with the substrate.

Aspectos estructurales y funcionales de la N-Succinil-L, L-diaminopimelato desuccinilasa, una enzima clave para el crecimiento bacteriano y un blanco para el control antimicrobiano

“…A pesar de lo mencionado, la enzima que más se ha estudiado tanto bioquímica como estructuralmente es la de Haemophilus influenzae (HiDapE), (Born, Zheng & Blanchard, 1998;Bienvenue et al, 2003;Davis et al, 2006;Gillner, Armoush, Holz & Becker, 2009b;Nocek et al, 2010;Nocek et al, 2014). La reacción se ha medido en diferentes condiciones de pH, desde 6.0 a 9.0, siendo de 7.5 a 8.0 el óptimo y una temperatura óptima de la reacción es entre 25 y 30 °C (Kindler & Gilvardo, 1960;Davis et al, 2006;Gillner, Armoush, Holz & Becker, 2009b;McGregor, Gillner, Swierczek, Liu & Holz, 2013;Hlaváček et al, 2014;Nocek et al, 2014). También se conocen los parámetros cinéticos de la reacción empleando NSDAP como sustrato, de la enzima de Escherichia coli (Kindler & Gilvardo, 1960) y Vibrio cholera (Nocek et al, 2014), (Cuadro 1).…”

“…La reacción se ha medido en diferentes condiciones de pH, desde 6.0 a 9.0, siendo de 7.5 a 8.0 el óptimo y una temperatura óptima de la reacción es entre 25 y 30 °C (Kindler & Gilvardo, 1960;Davis et al, 2006;Gillner, Armoush, Holz & Becker, 2009b;McGregor, Gillner, Swierczek, Liu & Holz, 2013;Hlaváček et al, 2014;Nocek et al, 2014). También se conocen los parámetros cinéticos de la reacción empleando NSDAP como sustrato, de la enzima de Escherichia coli (Kindler & Gilvardo, 1960) y Vibrio cholera (Nocek et al, 2014), (Cuadro 1). La reacción de DapE se ha medido con otros sustratos como el enantiómero D, L o con el derivado (2S,6S)-2-amino-6-[(3-carboxipropanoil) amino]-heptanodioato, pero se ha observado que la enzima guarda una estricta preferencia por el enantiómero L, L del NSDAP (Bienvenue, Gillner, Davis, Bennett & Holz, 2003).…”

“…Hasta la fecha se conocen las estructuras tridimensionales de HiDapE (en total 4 cristales), (Nocek et al, 2014(Nocek et al, , 2018Nocek et al, 2010), de Neisseria meningitidis (5 cristales), (Badger et al, 2005;Starus et al, 2015), de V.cholerae (2 cristales), (Nocek et al, 2014), de Corynebacterium glutamicum (1 cristal), (Brunger et al, 2012) y de Legionella pneumophila (1 cristal, sin publicación asociada, código PDB: 3PFE). También existe una estructura cristalina de una metalopeptidasa dependiente de Mn 2+ anotada como una probable DapE de S. aureus (Girish & Gopal, 2010), sin embargo, no es claro si es de este grupo de enzimas, ya que presenta una identidad aproximada de 25% con respecto a las otras DapE identificadas y parece ser específica por sustratos dipéptidos y no por el NSDAP.…”

“…Aunque las secuencias de las enzimas DapE presentan relativa baja identidad con respecto a HiDapE (de 20 a 60%), todas las conocidas hasta ahora y caracterizadas bioquímicamente pertenecen a la familia de las peptidasas M20. Éstas son un grupo de metaloenzimas (Nocek et al, 2014) homodiméricas (Figura 4 A) formadas por aproximadamente 400 residuos, con una masa molecular de 42,000 Da (Lindner, Lunin, Alary, Hecker, Cygler & Ménard, 2003;Okumura, Tamura & Takao, 2016). Globalmente cada subunidad (cadena A y B, codificadas por el mismo gen) de DapE consta de un dominio catalítico (Figuras 4 B, C y D) y un dominio de oligomerización (Figuras 4 E y F), ( Nocek et al, 2014) con plegamiento tipo ferrodoxina.…”

“…Éstas son un grupo de metaloenzimas (Nocek et al, 2014) homodiméricas (Figura 4 A) formadas por aproximadamente 400 residuos, con una masa molecular de 42,000 Da (Lindner, Lunin, Alary, Hecker, Cygler & Ménard, 2003;Okumura, Tamura & Takao, 2016). Globalmente cada subunidad (cadena A y B, codificadas por el mismo gen) de DapE consta de un dominio catalítico (Figuras 4 B, C y D) y un dominio de oligomerización (Figuras 4 E y F), ( Nocek et al, 2014) con plegamiento tipo ferrodoxina. DapE es un dímero obligado, ya que el sitio activo funcional está conformado por residuos de las dos subunidades, por el intercambio de dominios entre el catalítico de una subunidad y el de oligomerización de la otra (Nocek et al, 2018), es decir que en la intercara del dímero se extiende del plegamiento de una subunidad por la interacción de elementos de la estructura secundaria de la otra subunidad, fenómeno conocido como intercambio de dominios.…”