Muitos estudos técnicos e científicos têm sido realizados para a cultura do eucalipto, principalmente no que tange a área da propagação clonal em larga escala. Entretanto, em alguns estudos são necessários a obtenção de materiais assépticos via sementes, e para tal finalidade não se encontram protocolos eficientes de assepsia. Visto essa problemática, o presente estudo teve como objetivo a definição de um protocolo para assepsia de sementes de Eucalyptus grandis para o estabelecimento e germinação in vitro. Foram testados quatro métodos de assepsia utilizando fungicida a base de benomyl, solução hidroalcoólica (70% v/v) e hipoclorito de sódio (NaOCl), alternando a ordem de aplicação. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições. A porcentagem de estabelecimento e contaminação foram avaliadas ao final do experimento. O melhor método encontrado foi aquele em que se utilizou a sequência de lavagem com água esterilizada seguida de álcool 70% por 30 s, hipoclorito de sódio à 2,5% por 20 min, fungicida a base de benomyl 1% por 20 min e três lavagens com água esterilizada, correspondendo a 87,5% de estabelecimento.