Supplementation to the MRSMedium for the Cultivation of Fastidious Beer Spoilage Bacteria.

Abstract

Rýchla detekcia a kultivácia špecifických pivu škodlivých baktérií je vždy tak trochu problém a nie je vždy uspokojivo vyriešený, zvlášť pre niektoré druhy Lactobacillus a Pediococcus. Tento článok prezentuje nové médium na základe adaptovaného MRS média navrhnutého autormi DeMan, Rogosa & Sharpe v roku 1960. Nové médium je porovnávané z hľadiska veľkosti kolónií na platni a kinetiky rastu v tekutých médiách. Kinetika je sledovaná prostredníctvom optickej hustoty ako aj počtom kolónií tvoriacich jednotiek. Možno povedať, že pomocou nového média môžeme ľahko kultivovať a počítať niektoré z špecifických pivu škodlivých baktérií.

Lactic acid bacteria and cultivation methods of their detection - Part I.

“…Univerzální kultivační půda, která by umožňovala rychlou a spolehlivou detekci všech pivu škodících mléčných bakterií, neexistuje (Back, 2005)� V literatuře je uváděna široká škála kultivačních půd, které jsou větším či menším kompromisem mezi selektivitou, citlivostí a rychlostí růstu bakterií (Gillet et al�, 2004)� Autoři se zaměřují zejména na průkaz těch mléčných bakterií, které způsobují kažení hotového piva, popřípadě mají schopnost pivo negativně ovlivňovat již během jeho výroby� Půdy ke kultivaci mléčných bakterií musí obsahovat minerály, vitamíny a růstové látky� Součástí půd jsou inhibitory, které zabrání rozvoji kvasinek, plísní a gramnegativních bakterií a současně neovlivňují růst mléčných bakterií� K potlačení kvasinek je doporučováno antibiotikum aktidion, růst gramnegativních bakterií lze inhibovat β-fenylethanolem nebo azidem sodným (Boatwright a Kirsop, 1976;Casey a Ingledew, 1981;Taguchi et al�, 1990)� Mléčné bakterie jsou fakultativně anaerobní, doporučuje se jejich kultivace za anaerobních podmínek (Matsuzuva et al�, 1979;Šavel, 1980)� Detekci mléčných bakterií komplikuje také jejich pomalý růst, doba inkubace při 28-30 °C bývá 5-7 dní, někdy i déle, např� pro druh P. damnosus je charakteristický velmi pomalý růst kolonií (Back, 2005), u L. lindneri a L. paracollinoides celkově obtížná kultivovatelnost, zejména v konvenčních médiích (neobsahujících pivo, např� běžný MRS agar) při izolaci z piva/pivovarského prostředí (Suzuki et al�, 2008b)� Tento jev byl dále pozorován u kmenů L. acetotolerans izolovaných z piva (Deng et al�, 2014)� Pro účely stanovení pivu škodících mléčných bakterií byla vyvinuta řada různých kultivačních půd -tři z nich, MRS, Raka-Ray a modifikované NBB médium jsou obecně nejvíce používané� Mají rozdílné složení a jsou používány různým způsobem -v podobě koncentrátu, bujónu nebo agaru, případně s přídavkem piva� Tímto přídavkem není míněno vyšetřované pivo, ale sterilní pivo přidávané jako součást půdy� U některých mléčných bakterií byla prokázána adaptace na podmínky v pivu a při vyočkování na médium se složením naprosto odlišným od piva (obsah živin, pH, obsah solí, chmelových látek atd�) tyto bakterie nerostou� V provozní laboratoři je výhodné při pří-pravě půdy přidávat pivo vyráběné v daném provoze -předpokládá se adaptace pivu-škodících bakterií na toto pivo a tedy jejich snazší detekce (Jespersen a Jakobsen, 1996)� Pivo je do půd přidáváno v různém poměru -Taskila (2011) doporučuje přídavek piva do kultivační půdy alespoň 25 % (v/v), médium ABD podle Suzukiho et al� (2008b) obsahuje 100 % piva -k jeho přípravě se vůbec nepoužívá voda� 800 ml piva na 1l média obsahuje KOT médium (Taguchi et al�, 1990)� V 50� letech byla navržena široká škála půd vhodná pro detekci mléčných bakterií např� Brigg's Tomato Juice Medium obsahující rajčatový džus, Haynes Deep Liver médium s extraktem z jater, a půdy tion of haze and sediment, and production of organic acids and diacetyl (Back, 2005)� Some species of lactic acid bacteria (e�g� L. backii, L. paracollinoides, P. clausenii) have been described relatively recently, and their occurrence and harmfulness are not yet sufficiently known� Growth an...…”

“…In 1981 the Kirin brewery designed a KL-2B medium containing maltose as a carbon source, actidione for suppressing the growth of yeasts and sodium azide (NaN 3 ) to inhibit Gram-negative bacteria� The medium did not allow the detection of some pediococci and was therefore modified by adding beer (Taguchi et al�, 1990)� The new KOT medium (Kirin-Ohkoch-Taguchi) contained 800 ml beer in 1 liter of medium, maltose and glucose, and other substances (e�g� malic acid or cytidine)� To increase the selectivity for beer-spoiling lactic acid bacteria the medium was supplemented with cysteine hydrochloride� When compared with the original KL-2B, KOT medium supported the growth of more strains of Pediococcus and it was assessed as more suitable for microbiological quality control� Compared with NBB and VLB-S7 media it showed a higher capture of pediococcal contamination (Taguchi et al�, 1990)� Media KL-2B or OTC are not commercially available� Their complete composition is given in the report by Taguchi et al� (1990)� One of the modifications of the MRS medium is B-MRS, in which 250 ml beer is added to 1000 ml of the basic MRS culture medium (Holzapfel, 1992;Taskila et al�, 2010a)� Modification MRS B + was described by Gillet et al� (2004)� Basic MRS medium was enriched with sugars, growth substances and 10% beer� Compared to the basic MRS medium the test strains of the genera Lactobacillus and Pediococcus produced larger colonies, and in liquid medium they had a higher growth rate� MRS-broth containing beer was further used for the determination of beer-spoiling lactic acid bacteria by using so-called EnBase system consisting of continuous addition of glucose into the medium during the cultivation (Taskila et al�, 2009)� The supply of glucose is done through a biphasic gel which releases starch into the culture media; this is then immediately enzymatically degraded to glucose� Beer--spoilage lactobacilli (L. brevis, L backii, L. lindneri and L. malefermentans) proliferated in this system faster than during the comparative cultivation on B-MRS medium� When testing the system on contaminated samples bacterial growth was spectrophotometrically detected in 68% of the samples after 18 hours with EnBase and in 50% of the samples without enzyme system� After 48 hours of cultivation the growth was detected in all samples, with or without EnBase� When checking real beer samples, lactic acid bacteria propagated in several samples only when using EnBase� The advantage of the EnBase system is a gradual supply of glucose to the medium during the incubation period without an initial high glucose concentration that could cause osmotic shock to the cells (Taskila et al�, 2009)� Haakensen et al (2009 used MRS agar modified by the addition of beer for testing of hop-gradient agar plate technique for detection of lactic acid bacteria adapted on the stringent conditions of beer� Another modification of the B-MRS broth for determination of beer spoilage lactic acid bacteria is the so-called S-MRS (supplemented MRS) broth containing L-cysteine-HCl and sodium carbonate to reduce the dissolved oxygen content (Taskila et al�, 2010a)� On comparing the medium with the B-MRS, beer-spoiling L. brevis and L. backii grew faster in MRS-S while with real beer samples a slightly higher growth of bacteria was observed in B-MRS medium� Only those samples which contained the species...…”